培养基及其制备.ppt

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1、第六章 培养基及其制备,6 Medium and its preparation,提纲,培养基的成分能源物质 碳源物质 氮源物质 无机盐 微量元素和生长因子 水 前体物质 促进剂和抑制剂 淀粉水解糖的制备：酸解法、酶解法、酶酸结合法营养物质的调节 不同碳源的利用速度 氮源利用及与碳源利用的关系 碳、氮比例的调节 前体的控制 补料培养基的类型培养基的优化举例,第一节、培养基的成分,天然培养基 这是一种利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，人们无法确切知道其中成分。,M培养基(1L)：Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1g，MgSO4.7H2O 0.

2、5g，CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10g,pH 7.0,培养大肠杆菌常用培养基,合成培养基,按培养基的成分和目的,1、选择性培养基：就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是从混合菌样本中的选取优势菌，从而提高该菌的筛选效率。1)加富性选择培养基：用作加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，如甘露醇、纤维素、石蜡油、糖液等。2)抑制性选择培养基：选择性抑制剂有染料、抗生素、脱氧胆酸钠、叠氮化钠等。用于选择性的其他理化因素还有温度、氧、pH和渗透压等。,三、按培养基的成分和目的,2、鉴别性培养基 培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应

3、的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB 培养基。,培养基的成分 一、能源物质,微生物的一切行为都需要能源光能自养微生物：光能 如：螺旋藻生产单细胞蛋白 化能自养微生物：氢、硫、氨、亚硝酸 盐、亚铁盐等无机物 如：细菌炼铜，铁硫杆菌异养微生物：碳水化合物、石油、天然 气及石化产品,工业菌种绝大多数为化能异养型,二、碳源物质,碳源物质是培养基主要成分；占细胞干物质的50左右，提供能源、碳架、代谢产物。碳源物质 葡萄糖（单）：淀粉加工制备 蔗糖、麦芽糖、乳糖（双）：糖蜜、乳清 糊精、淀粉：其他碳源物质：脂类

4、（霉菌、放线菌）：充分通氧 有机酸、醇、石油产品：,谷 氨 酸 和 味 精 生 产 工艺,就目前的状况而言，发酵工业所用的原料作以淀粉或糖质为主，而许多微生物并不能直接利用淀粉。例如，在以糖质为原料发酵生产氨基酸过程中，几乎所有的氨基酸生产菌都不能直接利用（或只能微弱地利用）淀粉和糊精。同样在酒精发酵过程中，酵母菌也不能直接利用淀粉或糊精，这些淀粉或糊精必须经过水解制成淀粉糖以后才能被酵母菌所利用。此外，在抗生素、有机酸、有机溶剂以及酶制剂发酵过程中，大都也要求对淀粉进行加工处理以提供给微生物可利用的碳源。当然有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但这一过程必须在微生物分解出胞外淀粉酶类以后才能进

5、行，过程非常缓慢，致使发酵过程周期过长，实际生产上无法被采用。,玉米淀粉、谷物、马铃薯、木薯淀粉,淀粉水解糖的制备,一、淀粉水解糖的制备方法,葡萄糖值-DE值,工业上用DE值（也称葡萄糖值）表示淀粉糖的糖组成。糖化液中的还原糖含量（以葡萄糖计算）占干物质的百分率,还原糖含量DE值=100%干物质含量,用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质及采用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有酸解法、酶解法以及酸酶结合法等三种。,1、酸水解法原理,水解过程：,水解过程中存在三大化学反应：,复合二糖 复合低聚糖 水解淀粉 葡萄糖 5-羟甲基糖醛 有机酸、有色物质

6、,1,3,2,酶解法是利用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的方法。酶解法可分为两步：第一步，利用-淀粉酶将淀粉液化；第二步，利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解转化为葡萄糖。生产上这两步分别称为液化和糖化。由于在该过程中淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的。因此酶解法又称为双酶法或多酶法。,2、酶解法,缺点,酶解法是在酶的作用下进行的，反应条件较温和，不需要耐高温高压或 而酸腐蚀的设备；酶作为催化剂的特点是专一性强，副反应少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高；可在较高的淀粉乳浓度下水解。如酸解法一般使用10-12Bx（含18%-20%淀粉）的淀粉乳，而酶解法可用2023Bx（含34%

7、-40%淀粉）的淀粉乳，并且可以采用粗原料。用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，有利于糖液的充分利用。,酶解法反应时间较长，设备要求较多，且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。,优点,3、酸酶结合法,酸酶结合法是集中了酸解法和酶解法制糖的优点而采用的生产方法，它又可分为：酸酶法 酶酸法,酶酸结合法之一，酸酶法反应原理：淀粉糊精、低聚糖 葡萄糖优点：产品质量高，反应时间较短（2d）对原料要求较低，用酸量少。,酸水解,糖化酶,淀粉水解糖的制备,酶酸结合法之二，酶酸法反应原理：淀粉 糊精、低聚糖 葡萄糖优点：反应时间短（

8、2hrs），产品质量较好对原料要求较低，淀粉乳浓度较高。,淀粉酶,酸水解,30min,30min,淀粉水解糖的制备,三、氮源物质,氮源物质是培养基的主要成分之一。提供菌体结构物质，能源（少），含氮代谢产物，补充碳源。有机氮源：豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、酵 母粉、麦麸、鱼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素等。成分复杂，除含蛋白质、多肽、氨基酸外，还含糖、脂、无机盐、维生素及其他生长因子，对菌体生长非常有利。无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐 被吸收、利用快，但成分单一，常作辅助氮源。,品种、产地、加工方法对有机氮源质量的影响黄豆粉：全脂黄豆粉（含油脂18%）、低脂黄豆粉（9%以下）、脱脂黄豆粉（2%以下）棉籽

9、粉：低温提取油脂后加工品（pharmamedia）、高温（proflo）玉米浆：玉米淀粉副产物，干玉米浆、液态玉米浆、（国际知名品牌solulys L）,三、氮源物质,三、氮源物质,质量不稳定，引起发酵水平波动,无机氮源：铵盐、硝酸盐(NH4)SO4 2NH3+H2SO4NaNO3+4H2 NH3+H2O+NaOH代谢后产生酸性物质的营养成分叫生理酸性物质，反之叫生理碱性物质。注意溶液PH变化。,三、氮源物质,四、无机盐和微量元素,1)无机盐 成为菌体的组分或菌体内酶的调节剂、维持培养基一定的离子强度。对微生物的作用呈浓度相关,无机磷：菌体、核酸组成成分AMP，ADP，以及ATP合成酶或中间代

10、谢产物的修饰剂某些酶的调节剂有利于糖代谢，菌体生长，但不利于代谢产物合成,铁离子为细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成成分。一般不必加入。在有些品种的发酵中有害，如青霉素、四环素、麦迪霉素、柠檬酸、啤酒等。,钙离子作为微生物体内酶的激活剂，碳酸钙还可以作为控制发酵液pH的缓冲剂。镁离子作为微生物体内酶的激活剂。硫为蛋白质的组成成分，有时为某些代谢产物的组成成分。钠、钾离子调节渗透压和微生物细胞的通透性，调节某些酶的催化活性。,2)微量元素锌、钴、锰、铜、硼等作为酶的辅基或调节剂一般而言不必另外加入,3)无机盐及微量元素使用注意点,A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在

11、发酵过程中必须加以考虑。,例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理。,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。在合成培养基中需要补充在复合培养基中一般不须加入在某些特定的情况下需要加入一种或数种生长因子营养缺陷型菌种，如谷氨酸发酵中使用的菌种为生物素缺陷型,五、生长因子,六、前体物质,前体物质(Precursor)：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。抗生素(Antibiot

12、in)发酵中常用的前体物质：,青霉素G,青霉素V,六、前体物质,影响前体物质效力的因素菌种的特性前体物质的投入量(Inoculation concentration)前体物质的毒性(Toxicity),七、促进剂和抑制剂,促进剂Accelerator（刺激剂Stimulant）并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。作用原理：改变细胞的渗透性，或“启动”微生物体内的生产部位，否则这些部位是被阻遏的，因此促进剂的添加可以大大提高产量。常用促进剂：各种表面活性剂Surfactant（洗涤剂、吐温80、EDTA、植酸等）、大豆油提炼物、甲醇等。,Org

13、.Biomol.Chem.,2009,7,17531760|1753,七、促进剂和抑制剂,七、促进剂和抑制剂,抑制剂(Inhibitor)的作用原理：通过抑制某些合成其它产物的途径而使所需产物的合成得到加强。抗生素生产中的抑制剂：,八、水分,细胞的重要组分；细胞内一切生化反应的介质优良溶剂；（物质进出细胞）维持大分子结构的稳定；重要的物理性质：如：高比热；高汽化热；高沸点；冰的密度小于水等，保证 生命活动的正常进行。其质量对产品质量影响很大。,九 消沫剂,工业中利用消沫剂消除发酵中产生的泡沫：防止逃液和染菌植物、动物油脂（豆油、玉米油、猪油）、化学合成的高分子化合物,第二节、营养物质的调节,培

14、养基中各营养物的浓度和比例很严格。直接影响菌体的繁殖和产物的积累。尤其是碳氮比。（维持正常渗透压，节约原料也必需）。1.不同碳源的利用速度 2.氮源利用及碳源利用的关系 3.碳氮比例的调节 4.前体的控制 5.补料,培养基的种类,（一）孢子培养基：形成孢子。基质浓度（有机氮源）低，适当无机盐（二）种子培养基：孢子发芽、菌体生长。快速碳氮源、氮源和维生素含量高（三）发酵培养基：菌体生长繁殖、合成大量产物,一、不同碳源的利用速度,不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。如：青霉素产生菌利用葡萄糖快（30-40小时），利用乳糖速度慢（6天）。一般情况：单糖比双糖快；双糖比多糖快；纯多

15、糖比杂多糖快。快者为速效碳源，慢者为迟效碳源。,速效碳源(快速利用碳源)与迟效碳源(缓慢利用碳源)的搭配使用。控制浓度，生长期利用速效碳源，产物合成期利用迟效碳源。,二、氮源利用及与碳源利用的关系,不同氮源的利用速度也不同。如：铵盐比硝基氮更容易利用。简单的无菌氮源和氨基酸为速效氮源，复杂的有机氮源为迟效氮源。氨及铵盐等氮源的利用速度常随碳源的利用速度而变。糖代谢中间产物是氨基酸的前体。,速效氮源与迟效氮源的搭配使用类似于碳源的情况,三、碳氮比例的调节,碳氮比能直接影响微生物的生长和发酵产品的积累。碳氮比严格讲指元素比，但通常指原料比。一般情况：产物不含氮，细菌，；酵母菌，100:20；霉菌，

16、100:10。如：酒精发酵产物含氮，碳氮比较高。如：谷氨酸生产，100:15-21。,四、前体的控制,同前体对不同菌作用不同；不同前体对同种菌作用不同；同前体，同种菌，使用不同，效果不同。一般前体越多，增产越多；但大多毒性也增大。青霉素G：苯乙酰胺（），多次（1次/12小时）。同时要注意前体物质被作为营养物质利用。,五、补料,补料解决的问题：菌体早衰；料粘，搅拌能耗高，消泡难，溶氧降低，渗透压高。补料的目的和方法：限制生长速度；仅维持呼吸，半饥饿状态，利于产物合成；补足发酵液体积；控制好时间、速率和配比。抗生素的生产：中间补料量达到基础料的1-3倍。,生产上多用丰富培养基提高产量,红霉素发酵基

17、本培养基：玉米浆、黄豆饼粉、蔗糖，菌体生长达到高峰。补加蔗糖，红霉素合成重新开始。,五、补料,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,第三节 发酵培养基的设计和优化,当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。正交法、均匀分布法、响应面法,根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考

18、虑 的问题，初步确定可能的培养基成分；,通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；,培养基设计的步骤,类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化,郭秒,食品与工业发酵，2004,类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,三、培养基设计的步骤,原培养基:,三、培养基设计的步骤,通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一步：乙酸钠的浓度0.2%比较好,三、培养基设计的步骤,结果：,碳源：乙酸钠 0.2%,氮源：氯化铵 0.2%酵母膏0.03%,无机盐:复合无机盐0.05%,三、培养基设计的步骤,正交设计确定优化的配方,三、培养基设计的步骤,三、培养基设计的步骤,改进后培养基,原培养基,改进后培养基的发酵结果,三、培养基设计的步骤,本章知识结构,培养基的成分不同碳、氮源的利用速度营养物质的调节方法碳氮比例的调节 培养基的类型培养基的设计与优化,