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1、基本操作技术与应用,2010年2月23日-3月9日,基本操作技术与应用,天然药物活性成分的研究（了解内容）天然产物的提取方法（掌握内容）天然产物的分离方法（掌握内容）色谱分离法（掌握内容）天然产物的结构测定（熟悉内容）,研究途径,临床调查,收集原料,成分提取分离,成分预试验,活性筛选,文献资料调研,结构确定,动物试验,临床试验,提取的基本知识,什么是提取？提取的思路（已知成分、未知成分）提取前预处理（一般过2号筛为宜，同时注意酶的影响）基本原理相似相溶影响因素（溶剂的选择、方法选择、时间、温度、粉碎度等）极性,极性,常用溶剂极性排列顺序：石油醚苯无水乙醚氯仿乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水官能团的
2、极性排列顺序：烷烃卤代烃醚酯酮醛酰胺胺醇水酚羧酸,溶剂分类与特点（一）,水：价廉，安全，对细胞的穿透能力强。适用于无机盐、糖类、鞣质、氨基酸与蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类化合物的提取。亲水性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮等。特点：可与水任意比混溶，毒性低、价廉、回收方便，对细胞的穿透能力强。适用于多种成分的提取，其中，乙醇又称为“万能溶剂”。,溶剂分类与特点（二）,亲脂性有机溶剂：石油醚、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯等。特点：选择性强、回收方便、但易燃、有毒、价贵。适用于挥发油、油脂、叶绿素、树脂、游离生物碱、苷元等成分的提取。,提取技术与方法,（一）溶剂法：仅限于低分子量、含量高的成分的提取。根
3、据“相似相溶”的原则进行提取。（二）其他方法 根据化合物的特殊性质选择特殊的提取方法。水蒸气蒸馏法升华法,共9种方法,溶剂提取法,浸渍法渗漉法煎煮法回流法连续回流法超声提取法超临界流体萃取法,浸渍法,分为冷浸法（室温）和温浸法（4060）。常用溶剂：水、酸水、碱水、稀醇等。适用于遇热易被破坏的成分或含大量淀粉、粘液质、果胶、树胶等多糖类成分的提取。缺点：提取时间长、溶剂用量大、提取效率低、用水作溶剂时易发霉。,渗漉法,适用范围与提取溶剂同浸渍法。步骤：浸润、装筒、排气、浸渍、渗漉。优点：提取效率较高。缺点：提取时间长、溶剂用量大。,煎煮法,药房及家庭中最为常用的中药提取方法。常用溶剂：水适用于
4、对热稳定的成分的提取。含多糖类成分量大的药材因煎煮后呈糊状，不宜用本法。,回流法,最常用的提取方法。对热不稳定的成分不适用。提取效率较高。选择什么试剂？适用于什么成分？,连续回流法,浸渍法和回流法的特点兼有。对热不稳定的成分慎用。提取时间长。,超声提取法,利用超声波振动产生的能量在提取液中产生“空化现象”提取有效成分。优点：操作简便，几乎适用于各种溶剂的提取，提取时间短，效率高。,超临界流体萃取法,超临界流体（supercritical fluid，SF）：当某物质处于临界温度和临界压力以上时可形成一种既非液体又非气体的单一相态，将这一状态的物质称为超临界流体。目前最常用的是CO2-SFE技术
5、。,水蒸气蒸馏法,适用于具有挥发性，可与水蒸气一起蒸馏出来，与水不反应，又难溶于水的化合物的提取。,升华法,适用于有升华性，升华温度适当，遇热较稳定的化合物的提取。可分为常压升华和减压升华两种。,关于提取问题小结,极性（溶剂的极性、化合物的极性）提取溶剂的分类与特点提取的原理提取的方法与适用范围,分离方法,（一）分离前处理（二）结晶与重结晶（三）分离方法系统溶剂分离法两相溶剂萃取法沉淀法 6.透析法 9.色谱法吸附法（补充）7.分馏法盐析法（补充）8.升华法,分离前处理,提取液一般体积较大，目标成份浓度低，需要先浓缩提高浓度，然后再进行分离工作。浓缩的方法常压蒸馏减压蒸馏薄膜蒸发,常压蒸馏,适
6、用于有效成分受热不易分解，低沸点有机溶剂（氯仿、乙醚、石油醚等）的提取液的浓缩。,减压蒸馏,适用于溶剂沸点高，有效成分受热易分解的提取液的浓缩。,薄膜蒸发,浓缩效率高，受热时间短，特别适用于浓缩水或稀醇为溶剂的提取液。,结晶与重结晶,（一）结晶的条件（掌握)（二）结晶溶剂的选择(熟悉）（三）制备结晶的方法 1.晶核的形成 2.晶链的延长（四）结晶纯度的判断(重点掌握）,结晶的条件,被分离化合物纯度高；呈过饱和状态；最适结晶温度：510；充分放置。,结晶溶剂的选择（理想溶剂）一,不与结晶物质起化学反应；杂质与结晶物质在溶剂中的溶解度相差大；目的物在溶剂中的溶解度随温度不同有显著差别；溶剂沸点不宜
7、太高或太低（可在60）；溶剂沸点低于化合物的熔点；溶剂沸点低于结晶温度；能给出较好的晶形，无剧毒。,结晶溶剂的选择 二,常用溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等。其他不常用溶剂：二甲基亚砜、乙腈、甲酰胺、二甲基甲酰胺、冰醋酸等。混合溶剂？如何选择与使用 水-乙醇；乙醇乙醚；石油醚苯；水丙酮；乙醚乙酸乙酯乙醇等。,结晶纯度的判断,一定的晶形、均匀的色泽；有固定的熔点，熔距较小；TLC：经过三种以上展开剂展开得均一圆形的斑点。,系统溶剂分离法,目前是研究成分不明的天然产物的最常用方法。选择34种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步对粗提物进行分离。手续复杂、对化学性质不稳定，容易引起分解、异构
8、化的产物应特别注意。,两相溶剂萃取法,（一）基础知识原理分配系数与分离因子（二）萃取方法,基础知识,一、原理 利用混合物中各成分在两种互不混溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的目的。二、分配系数与分离因子分配系数（K）K=C有机相/C水相分离因子（）=KA/KB,假设KA=10，KB=0.1，则=100当100时，一次简单的萃取就可以完成分离；当10100，需萃取1012次；当2时，需要完成100次以上的萃取；当1时，理论上无法完成萃取分离的目的。,萃取方法,简单萃取法（掌握）pH梯度萃取法（重点掌握）（补充）逆流连续萃取法（了解）逆流分溶法（counter current distributi
9、on CCD)（了解）液滴逆流分配法（droplet counter current chromatogrophy DCCC）（了解）,简单萃取法,适用于分离因子较大的情况的分离。提取液的密度最好在1.11.2。“等量多次”原则（掌握）乳化现象（熟悉）,等量多次原则证明,设Vml水中含有Wg溶质，用Sml有机溶剂萃取后，在水中尚有W1g溶质没有被萃取出来，则分配系数KD为：,整理得,第2次再用Sml有机溶剂萃取水中的溶质后仍有W2g没有被萃取出来，则,因此，若每次用Sml有机溶剂萃取，最后剩在Vml水中的溶质Wn为,若一次用nSml有机溶剂萃取，剩余在水中的溶质,结论,用总量相同的溶剂，分多次
10、萃取的效率要比1次萃取的效率高。,乳化现象,产生原因天然产物中含有皂苷、蛋白质、植物胶质、鞣质等表面活性物质；两相互不相溶的溶剂；振摇；少量轻质的沉淀等。,解决方案较长时间静置；2.将乳状液分出，再换新溶剂萃取；3.将乳状液加温或冷冻；4.将乳状液抽滤；5.加入少量电解质（如 NaCl等）；6.加入少量低级醇（如乙醇、戊醇等）。,pH梯度萃取法,是分离酸性、碱性、两性有机化合物常用的手段。原理：由于溶剂系统PH的改变，改变了化合物的存在状态（游离型或解离型），从而改变了化合物在溶剂系统中的分配系数。酸性化合物：pH=pka-2 游离；pH=pka+2 解离。碱性化合物相反。,以酸性化合物HA为
11、例,酸性化合物在水中电离：,电离常数,取负对数,逆流连续萃取法,操作简便；萃取完全，不易乳化；适合于两相互不混溶的溶剂的密度相差较大的系统的分离。,逆流分溶法（CCD),适用于性质相似的异构体或同系物的分离。特点：条件温和，样品易于回收。注意：溶质浓度越低分离效果越好。,液滴逆流分配法（DCCC）,CCD的改进方法，不易乳化。特别适用于皂苷类化合物的分离。需要动力泵。,沉淀法,可以分为酸碱沉淀、试剂沉淀、铅盐沉淀。酸碱沉淀：适用于酸性、碱性物质的分离。试剂沉淀 沉淀试剂沉淀 有机溶剂沉淀3.铅盐沉淀 中性醋酸铅 碱性醋酸铅,吸附法（补充）,选择适宜吸附剂（如硅胶、Al2O3、活性炭）去除杂质或
12、选择性筛选目标成分。如用活性炭去除在提取液中的叶绿素等脂溶性成分。,盐析法（补充）,在水提液中加入NaCl、MgCl2等无机盐促进极性稍大组分析出的方法。如盐酸小檗碱易溶于热水，在冷水中溶解度小，但在结晶冷却过程中不易析出结晶，可通过加入NaCl固体的方法促进析晶。,透析法,色谱法,吸附色谱(adsorption chromatography)分配色谱/液相色谱(patition chr.)离子交换色谱(ion exchange chr.)大孔吸附树脂法(macro-reticular resine method)凝胶色谱法(gel filtration chr.)气相色谱法(gas chro
13、matography)高效液相色谱（high performance liquid chromatography),吸附色谱,基本原理：利用混合物中不同组分分子、溶剂分子与吸附剂表面分子间的作用力不同，引起不同的吸附性能而进行分离。吸附剂色谱结果操作方式,极性吸附剂：硅胶、氧化铝 吸附剂 非极性吸附剂：活性炭 聚酰胺硅胶：微酸性，不宜直接用于碱性物质的分离。颗粒表面的硅醇基起吸附作用，需在105110 活化。氧化铝：微碱性，不宜直接用于含醛基、羰基、酯基化合物的分离。活性炭：多用于水提液中脂溶性杂质的分离。,4、聚酰胺：酰胺基可以与羟基、羧基、硝基等形成氢键。分离规律（P67）：氢键越多，吸附
14、越牢，Rf越小。如易形成分子内氢键，Rf增大。芳香化程度越高，吸附越牢。各种溶剂的洗脱能力：水甲醇丙酮NaOH水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,操作方式,薄层色谱（thin layer chromatography,TLC)操作步骤：制板 点样 展开 定位柱色谱 操作步骤：吸附剂与洗脱剂选择 装柱 上样 洗脱 分离,注意活化,分配色谱,（一）基本原理：根据被分离物质在两相中的溶解性不同而进行分离（CCD）。（二）正相色谱与反相色谱（掌握）（三）支持剂：硅藻土、纤维素粉、滤纸、含水17%的硅胶等。（四）操作方式 1.纸层析(PC)2.TLC 3.柱层析,正相色谱：固定相的极性大于流动相的极性。
15、固定相多为强极性溶剂，如水、缓冲液等。反相色谱：固定相的极性小于流动相的极性。固定相多为亲脂性溶剂。,支持剂的要求,无吸附作用；不溶于两相溶剂中；不与被分离物质发生化学反应；并能吸着一定的固定相；可以使流动相自由通过而不改变其组成。,离子交换色谱（IEC）,（一）分离原理：利用离子交换树脂在水溶液中可以解离，并与溶液中其它离子产生可逆性的交换，达到分离离子型化合物的目的。（二）离子交换树脂（熟悉）（三）分离结果（重点掌握）（四）离子交换树脂的选择（了解）（五）操作（了解）,离子交换树脂,阳离子交换树脂：能与溶液中阳离子进行交换，按交换活性分为强酸型阳离子交换树脂和弱酸型阳离子交换树脂两类。如：
16、RSO3H+NaCl RSO3Na+HCl阴离子交换树脂：能与溶液中阴离子进行交换，按交换活性分为强碱型阴离子交换树脂和弱碱型阴离子交换树脂两类。如：RNOH+NaCl RNCl+NaOH,样品,强酸型阳离子交换树脂,酸性及中性物质,强碱型阴离子交换树脂,稀NH4OH洗脱,洗脱液（碱性及两性）,中性物质,稀碱洗脱,洗脱液（酸性物质）,强碱型阴离子交换树脂,碱性物质,稀酸洗脱,洗脱液（两性物质）,流出液,流出液,流出液,离子交换树脂的选择,根据被分离物质选择树脂，如分离生物碱选择阳离子交换树脂。根据被分离物质的解离常数选择，如碱性强选择弱酸型阳离子交换树脂。根据化合物大小选择，如分离大分子化合物
17、可选择交联度36%的树脂。,操作,预处理：水浸泡（溶胀）酸碱处理（洗去杂质）水洗至中性装柱上样与洗脱再生,大孔吸附树脂法,主要用于水溶性化合物的提取分离。大孔吸附树脂（吸附性与范德华力、氢键有关）大孔吸附树脂类型影响因素：1.分子极性大小；2.分子体积大小；3.pH值的影响。预处理与再生,大孔吸附树脂的特点,吸附性和筛选性相结合的分离材料选择性好吸附容量大机械强度高再生处理方便吸附速度快解吸容易不易受到无机盐等离子或小分子化合物的影响,大孔吸附树脂类型,非极性吸附树脂（芳香族吸附剂）：以苯乙烯为单体，二乙基苯为交联剂。中极性吸附树脂（脂肪族吸附剂）：以甲基丙烯酸酯作为单体和交联剂。极性吸附树脂
18、：结构中含有硫氧、酰胺、氮氧等极性基团。,预处理与再生,预处理：水洗、溶胀后用甲醇或95%的乙醇浸泡24小时，至洗涤液加水后不呈白色浑浊，最后用蒸馏水洗掉有机溶剂。再生：蒸馏水、甲醇、乙醇反复洗涤，必要时可用3%的盐酸水溶液或3%的氢氧化钠溶液再生。,凝胶色谱法（GFC）,原理：“分子筛”凝胶的种类1.葡聚糖凝胶（Sephadex G）2.羟丙基葡聚糖凝胶（LH-20）,气相色谱法：适用于沸点低，易挥发，对热稳定的化合物的分离。HPLC电泳技术,结构测定,(一)鉴定天然产物化学成分的一般步骤1.化合物纯度测定2.初步推测化合物类型3.测定分子式、计算不饱和度4.确定官能团或结构片断5.确定分子
19、的平面结构6.确定分子的立体结构(二)结构测定中波谱知识回顾,纯度测定方法,1.结晶的性质2.层析行为（PC、TLC）3.GC4.HPLC5.电泳,分子式测定方法、不饱和度的计算,分子式测定方法（MS）：1.元素定性分析2.高分辨质谱法（HR-MS)不饱和度的计算 U=(2+2n4+n3-n1)/2,例1：元素定性分析,定量分析结果：C：79.35%，H：10.21%所以，O=100-79.35-10.21=10.44%三元素在结构中所占比例为：C=79.35/12.01=6.61 10.16H=10.21/1.008=10.13 15.58O=10.44/16.00=0.65 1分子式为（C
20、10H16O1）n如MS的分子离子峰为456，则n=3,例2：高分辨质谱法,以12C=12.000000为基准，1H=1.00782514N=14.00307，16O=15.99491故：C8H12N4 164.1063 C9H12N2O 164.0950 C10H12O2 164.0837 C10H16N2 164.1315分子量均为164，但精确质量不一样，可用于区别化合物。,常用波谱知识回顾,紫外光谱(UV)红外光谱(IR)核磁共振(NMR)质谱(MS)练习,紫外光谱,用不同波长的紫外光为光源（200400nm），依次照射一定浓度的样品溶液，分别测定其吸光度（A），并用波长对吸光度（或摩
21、尔吸光系数）作图，得紫外吸收光谱图。应用：定性鉴别、纯度检查、单组分的定量分析以及结构解析（辅助手段）。只能显示分子中部分结构的特征。,可鉴定的结构片断某种发色团的存在；顺反异构体的鉴定；吸收带R带：杂原子的不饱和基团，波长270nm,弱吸收；可随溶剂极性的不同而移动。K带：共轭结构，强吸收。B带：芳香化合物，似掌状，256nm左右，弱吸收。E带：芳香化合物，强吸收，可分为E1（180nm)和E2(200nm)两个峰。,红外光谱,广泛用来鉴定化合物的结构，简单迅速，可靠。用波长2.5-15um（4000-667cm-1）的光波为光源依次照射样品，以波数（或波长）为横坐标，百分透光度为纵坐标绘制
22、的谱图。与紫外光谱的区别：IR为振动-转动光谱适用范围广特征性强,IR的九个重要区段：37503000cm-1:-OH,-NH33003000cm-1:CH,=CH,Ar-H30002700cm-1:饱和CH,-CHO24002100cm-1:-CC,-CN19001650cm-1:C=O16751500cm-1:C=C,C=N14751300cm-1:CH13001000cm-1:C-O(酚、醇、醚）1000650cm-1：=CH,影响峰位的因素,诱导因素：如吸电子诱导效应使峰向高频方向移动。共轭因素：使峰向低频方向移动。氢键：使峰向低频方向移动。,核磁共振,用60cm300m波长的无线电波
23、照射样品，只能引起原子核的自旋能级的跃迁。1H-NMR、13C-NMR、二维核磁共振谱（N+1)律峰位：烷基H 1ppm，ArH 7ppm等。,质谱,主要特点：灵敏度高分析速度快测定对象广主要用途：测定准确的分子量鉴定化合物测定分子中Cl,Br等原子数,光谱解析练习一,某未知化合物的分子式为C14H14,通过光谱解析推测结构。,光谱解析练习二,化合物分子式如下，指出下列各峰归属。,1.2 CH2CH3 2.0 COCH3 4.0 OCH2CH3 6.87.6 C6H4 9.8 NH,光谱解析练习三,化合物分子式为C10H10Br2O，推测其结构式。,小结,常用溶剂的分类与极性比较。常用的提取、分离技术与选择原则。浓缩方式。结晶纯度的判断。乳化现象的产生与消除。pH梯度萃取法。,常用吸附剂与使用注意。吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱分离化合物的原理。化合物结构测定的一般步骤。CCD、DCCC、HPLC、GC、IEC、GFC、UV、IR、NMR、MS的含义。,
