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1、酸性磷酸酶Km及Vmax值测定清洗试管24支,酸性磷酸酶:催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏,前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。是生物体中重要的一种酶类,为某些疾病的检测指标。,一、概述,酶液 磷酸苯二钠 苯酚 磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度 计算出反应速度(用产物生成量/min来表示)根据双倒数法计算出Km及Vmax,二、实验原理,三、实验步骤:1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线3、制作酚标准曲线 4、S与V0关系实验 5、双倒数作图法计算Vmax和Km,buffer,substrate,enzyme,Certain Time,bl
2、ank,Stop the reaction,Color developed,生化实验课老师:于晓虹实验报告请交到讲台上来酶液稀释取上清液微升,稀释倍,用大试管装科代表李博恒,1、磷酸酶原液的制备:称取5g绿豆芽茎(去头去根),加入pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤,取1.8ml滤液,以6000rpm,离心20min,取上清。上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍,用于实验。,2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线(目的:选取合适的反应时间),加 液 程 序 表管号 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5酶
3、液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5精确反应时间 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 酶液 0.5Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin酚溶液已稀释好!注:进行酶促反应时,注意预热,使所有的反应在同等条件下开始,35保温10分钟,结果:,以反应时间为横坐标,A680nm为纵坐标,绘制反应进程曲线,并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初速率的时间范围。,3、制作酚标准曲线(目的:可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算出反应速度(用每分钟产物生成量来表示),加 液 程 序 表,35保温10分钟
4、,结果:,以酚含量(mol)为横坐标,A680nm为纵坐标,绘制标准曲线。,以0号管作空白,在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度(A680nm)。,4、S与V0关系实验,实 验 加 液 程 序 表管号 1 2 3 4 5 6 0磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20-酶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50-精 确 反 应 15 分 钟 35度碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 Folin酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液 0.5 35保温10分钟测680nm处吸光度 注:进行酶促反应时,注意预热,使所有的反应在同等条件下开始,实验中需注意事项:酶反应作用时间精确控制,实验结果,1、酚含量从酚标准曲线上查得2、V0 反应初速率(mol/min)为酚含量除以酶反应时间(15分钟)。3、双倒数作图法计算Vmax和Km,