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1、2023脊髓损伤基础研究存在的问题及改进建议摘要：脊髓损伤致死率和致残率极高，其治疗一直是世界难题。随着医疗救治手段的进步，脊髓损伤患者的生存率有所提高，但脊髓损伤的临床疗效仍不理想。中国在脊髓损伤基础研究方面取得了重要进展，如解析脊髓损伤修复机制、研发多种细胞疗法和生物支架等治疗脊髓损伤。然而，部分基础研究对脊髓损伤微环境和动物模型认识不足或缺乏临床问题支撑，导致研究结论过于浅显甚至互相矛盾，迫切需要重新审视研究方法，开展基础研究与临床转化相结合的研究。为此，笔者探讨脊髓损伤基础研究存在的关键问题和困难，并提出改进建议，为正确开展基础研究和加速临床创新转化提供新思路。关键词：脊髓损伤；模型，
2、动物；临床研究脊髓损伤常由交通伤、高处坠落伤等引起，导致严重的神经功能损害甚至瘫痪，给患者家庭和社会带来沉重的负担1。随着医疗救治手段的不断进步，脊髓损伤患者的生存率有所提高，但预期寿命仍大幅度降低2。近年来，中国在脊髓损伤基础研究方面创新性提出脊髓损伤后微环境紊乱理论3,初步解析成年非人灵长类动物脊髓损伤修复的机制4,研发多种细胞疗法和生物支架，为治愈脊髓损伤带来了新的曙光57。但由于脊髓损伤自身特点、神经损伤修复困难及技术条件限制，脊髓损伤的临床疗效仍不理想89。目前，脊髓损伤的基础研究缺乏临床患者关键信息和可靠数据的支撑，也无法全面地把握脊髓损伤微环境失衡的特点；同时，由于动物模型和实验
3、体系的局限性，无法准确模拟人脊髓损伤后的病理生理变化和神经功能恢复过程，导致无法得出有意义和可靠的结论，也难以形成脊髓损伤防治的新策略和新方法。为此，笔者探讨脊髓损伤基础研究存在的关键问题和困难，并提出改进建议，为正确开展基础研究和加速临床创新转化提供新思路。01脊髓损伤基础研究存在的问题1.1 对脊髓损伤微环境时空异质性认识不足脊髓损伤是持续时间长且不断变化的复杂过程,而微环境紊乱是其中一个显著的病理特征。笔者在国内首先定义脊髓微环境这一概念，并提出脊髓损伤后微环境紊乱是多层次、多水平、多维度的3。脊髓损伤后，微环境中的非免疫细胞、免疫细胞及非细胞成分能够快速响应环境变化，在损伤后不同阶段呈
4、现动态、差异化表现，构成时间异质性。而上述各类成分组成在微环境中不同区域（如损伤中心、损伤中心头端邻近区域、损伤区域尾端邻近区域等）的分布、相对丰度和功能状态也都存在显著差异，构成空间异质性10-11o研究人员最初运用免疫组织化学技术来认识脊髓损伤微环境的时空异质性，但受限于组化技术仅能标记几种微环境成分，导致有些认识和结论过于浅显12o而测序技术由于无法区分微环境内各种成分，对数据的解读也十分有限口引。以巨噬细胞/小胶质细胞为例：既往M1和M2极化的概念来源于体外研究，简单的二分法并不能反映体内复杂的异质性。因此，去除Ml型巨噬细胞/小胶质细胞、诱导巨噬细胞/小胶质细胞向M2型极化等基础研究
5、成果无法得以临床转化，甚至出现与预期相矛盾的结果14。笔者认为，只有全面解析脊髓损伤微环境的时空异质性，才能避免盲人摸象式解读脊髓损伤的病理过程，实现从基础研究到临床转化。1.2 脊髓损伤研究动物模型的局限性虽然脊髓损伤治疗的基础研究取得令人瞩目的进展，诸多治疗方法和策略可在临床治疗中发挥效果，但绝大部分无法成功转化为有效的临床治疗方法8。笔者认为，主要原因为脊髓损伤研究中动物模型选择、动物功能评估和研究过程异质性过大：（1）动物和模型选择的局限性。目前在脊髓损伤基础研究中，绝大部分造模使用大鼠和小鼠。大鼠价格低、易获取，且在脊髓形态和电生理特点上与人类相似；小鼠与人类在基因水平上高度同源，利
6、用转基因小鼠研究脊髓损伤后的分子机制和免疫反应具有巨大的优势15。但啮齿类动物神经解剖结构的组织模式和复杂程度、运动技巧及认知能力等均与人类差异悬殊，只能完成关节屈伸和肢体协调等常规动作而无法完成精细的复杂动作，这在以治疗人类脊髓损伤为目的的研究中存在明显不足口6-17o灵长类动物的脊髓组织和神经结构比啮齿类动物更接近人类，更适用于脊髓损伤研究，研究人员能够设计复杂且有针对性的运动任务，为脊髓损伤的诊疗提供具有参考价值的数据18。但在实际研究中因成本较高、伦理和模型不稳定等情况,灵长类动物未能被普遍使用口9o目前，脊髓损伤模型主要包括脊髓横断模型、挫伤模型、压迫模型、缺血损伤模型和光化学损伤模
7、型等20。尽管模型多样，但各有其优缺点，尚无一种能完美模拟人类脊髓实际受伤机制的模型。因此，在研究中必然表现出固有的局限性。（2）脊髓损伤动物模型功能评估方法的局限性。如对啮齿类动物的功能评估主要包括行为学评估、影像学评估、神经电生理学评估、组织学评估等21。BBB评分是目前应用最广泛的评估脊髓损伤动物运动功能的方法，但BBB评分不是线性的，评分高低并不能准确反映动物脊髓损伤的严重程度22。动物步态分析系统可量化研究小鼠的脚印和步态，捕捉真实的足印、足迹和体重分布并提供准确客观的数据，评估动物后肢功能恢复，但该方法不适用于脊髓损伤早期和严重脊髓损伤2324o动物脊髓损伤模型中，相同面积的损伤可
8、能会导致完全不同的功能损害和预后2526;同样,不同脊髓损伤患者中,即使原发病灶的位置和面积相似，造成的功能障碍和采取的重建方法也存在较大差异。因此，影像学（X线片、CT和MRl）和组织学评估无法准确判断脊髓损伤的严重程度和治疗效果。（3）研究过程的不稳定性。如目前使用最广泛的小鼠脊髓损伤打击模型，不同研究中即使选择相同的动物和损伤模型，实验本身的设计和操作细节也千差万别，主要体现在以下方面：不同团队对脊髓损伤动物的功能评估不准确：比如检测仪器是否可靠、损伤前是否对动物进行统一训练、损伤后检测的时间点安排是否合理有效，以及脊髓损伤动物的生存环境和饮食等，均会对实验结果产生一定的影响；造模不稳定
9、：目前挫伤模型选择的打击头直径不一致，即使打击头的直径、力学固定，可能由于打击瞬间小鼠发生抖动导致结果不稳定；取材难控制：取材切片不稳定，层面难以控制均一；损伤节段不固定：目前大多数研究选择的损伤节段为T8T10,但具体造模时损伤节段也并不固定2729。笔者认为，对于脊髓损伤的动物研究，需要根据研究内容和目的选择合适的动物模型和评估方法，提升实验的稳定性和可重复性。1.3 缺乏临床研究对基础研究的支撑近年来，基础研究成果向临床应用转化的理念已深入人心，研究人员更多关注基础研究到临床转化这一过程，而相对忽视临床问题对基础研究的反馈作用。只有基础研究与临床诊疗相互促进、相互结合，才能突破基础研究瓶
10、颈和解决临床实际问题。我国深入开展了脊髓损伤研究，但在实际研究中存在如下不足：（1）缺乏覆盖全国的脊髓损伤流行病学调查研究。通过流行病学调查，了解不同地区脊髓损伤的发病率、发病原因、患者年龄及性别等数据，不仅可以针对不同地区不同年龄段人群给出相应的脊髓损伤预防指导，制订个性化救治流程，有利于患者得到及时有效的救治，减少二次损伤和相关并发症的发生，还对模型动物的选择（种属、性别、周龄等）和实验细节设计（损伤节段、损伤类型、观察时间等）起到决定作用30。(2)队列研究相对匮乏。队列研究不仅能够帮助研究者凝练脊髓损伤领域的关键临床问题和需求、引领基础研究的方向，还可为基础研究提供大量的临床数据和生物
11、样本。目前，我国已开展的脊髓损伤队列研究多为单中心、小型研究项目，尚无大规模全国性脊髓损伤队列研究3132;仅限于脊髓损伤患者基本情况和诊疗过程，缺乏对发病机制、康复效果和预后影响等方面的深入探讨33;受社会经济水平和文化水平差异影响，研究往往只能在一些特定地区和特定人群中进行3435。这些因素不利于全面、系统地解析脊髓损伤的病理生理过程、制订有效的治疗策略。缺乏脊髓损伤患者队列研究,严重掣肘相关基础研究的进展和深度36-370(3)缺乏标准化、可共享的脊髓损伤患者生物样本库。生物样本是连接基础与临床的桥梁，通过生物样本库可以鉴定干预靶点、探索疾病发病机制、筛选疾病相关分子标志物，指导疾病的分
12、子分型与个体化治疗。由于受医学伦理的限制，损伤脊髓标本难以获取，脊髓损伤患者的脑脊液、血液和尿液等便成为重要的生物样本。我国脊髓损伤患者生物样本库的建立起步晚,缺乏统一的标准化管理流程和质控体系，信息化程J度低。除此之外，我国生物样本库普遍缺失治疗和随访数据，利用价值不高；缺乏顶层设计的低效使用将造成不可再生的生物样本资源浪费，样本利用率不高；国内各样本库多隶属于某一医院或某一学科，实行封闭式管理，共享率低38。笔者认为，在基础研究取得进展的同时，临床研究若相对滞后，将无法为脊髓损伤基础研究的整体发展提供更多支撑。02脊髓损伤基础研究的改进建议2.1 深层次解析脊髓损伤微环境的时空异质性近年来
13、，高分辨、高通量、多维度的单细胞测序技术的兴起极大推动了脊髓损伤微环境时空异质性研究。小鼠脊髓损伤后，小胶质细胞即刻被激活并分泌细胞因子和趋化因子招募单核巨噬细胞39。脊髓损伤后1周，巨噬细胞的数量达到峰值并聚集在损伤中心，与位于损伤中心外围的小胶质细胞共同调控损伤区域的免疫与炎症反应40。脊髓损伤微环境中的小胶质细胞/巨噬细胞表现出高度异质性，但长期被简单地划分为MkM2两种极化状态。Li等41发现，新生小鼠的脊髓损伤区域存在一群促进再生的小胶质细胞亚群这群细胞高表达细胞外基质相关基因（Fnl和ThbSl）和抗炎基因（CStb、StfakSerPinb6a和AnXal）,能促进炎症的快速清除
14、和细胞稳态的重建,具有促进损伤无瘢痕修复的功能。Wang等42发现，脊髓损伤早期残存的小胶质细胞可以重编程至一种新生状态以重新增殖，其中Hifl娓调控这一过程和脊髓损伤修复的关键蛋白。Hakim等43的研究结果表明，脊髓损伤后小胶质细胞通过转录重编程，转变为与疾病相关小胶质细胞类似的小胶质细胞亚群（Glmp和Nfe2l2）z并促进小鼠运动功能恢复。星形胶质细胞在脊髓损伤后3d处于增殖的高峰期并分布在损伤区域；伤后1周该细胞逐渐形成外层的星形胶质细胞瘢痕围绕整个损伤区域44。既往认为星形胶质细胞可分为具有促炎作用的A1型和具有神经营养、组织修复功能的A2型45。而Hou等46利用单细胞测序发现,
15、脊髓损伤后损伤中心附近存在6个不同亚群的星形胶质细胞（分别为AtPlb2+、S100a4+xGpr84+sC3+G0s2+xGFAPTm4sf1+和Gss+Cryab+）,损伤后不同阶段星形胶质细胞亚群中高表达基因呈现动态演变过程。此外,Shu等47发现，脊髓损伤后存在2个不同的神经干细胞亚群（以Sox9.S1OObxCluxGjal和Id4为特征基因的静息型以Rpl32xCdkl和Ccna2为特征基因的激活型），其中分布在脊髓中央管外的亚群表现出激活的神经干细胞特性，伤后5d呈高度异质性并表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征基因。Matson等48的研究结果表明，脊髓损伤后存在一群表
16、达再生相关基因的神经元（Atf3和Sprrla这些研究结果不仅进一步揭示脊髓损伤的病理过程，也加深了对脊髓损伤微环境时空异质性的认识。然而，脊髓损伤微环境中细胞种类众多，中性粒细胞、淋巴细胞、少突胶质细胞等组分的异质性尚不明确。目前，对脊髓损伤微环境空间异质性的认知仍十分匮乏。今后，我们需转变观念，以脊髓损伤微环境中各类细胞亚群为单位，研究其表型和功能；还要从时空异质性出发，揭示某一时间点、特定区域内不同微环境类型组合共定位背后的生物学意义及相关临床特征，为基础研究成果向临床应用转化带来新突破。2.2 完善动物模型设计基础研究可为人类提供有治疗潜力的预测靶点或药物。为突破基础研究的困境、提高基
17、础研究的临床转化能力，笔者认为应从以下方面加以改进:（1）从多个方面提升动物模型的有效性。尽可能控制动物模型的各种变量，包括性别、年龄、体重、基因背景、生存环境、温度和饮食等。避免从一个维度评估脊髓损伤功能的恢复，要结合髓鞘和神经元病理染色、影像学、神经电生理和行为学等多个方面；综合考虑脊髓损伤的部位和严重程度、动物的行为方式和行动能力等选择合适的评估方法，提升评估的准确性。（2）对包括异常数值在内的所有数据进行更全面的分析。正如脊髓损伤患者受伤时和治疗阶段展现出巨大的异质性一样，即使同一品系的小鼠，在受到相同的损伤和治疗时，也会产生不同的反应。在精确控制动物模型变量和完善相关实验设计后，应正
18、确认识出现的多变的数据结果，不强求模型的绝对一致性。（3）研究结果的重复测试和验证。对有突破性的研究成果应该在多种动物模型中进行测试，尤其是非人灵长类动物；委托第三方实验室对基础研究结果进行重复性验证也十分必要。只有高稳定性和可重复性的基础研究才能确保临床转化的可能性。（4）拓展损伤部位选择。大多数动物脊髓损伤模型为胸段损伤模型，最常见的损伤节段是T8T10,表现为下肢、尾部运动感觉功能障碍及排尿、排便功能障碍。而许多脊髓损伤患者发生在颈段，其损伤严重程度也超过了实验性损伤强度。动物胸段脊髓损伤模型不能模拟颈段脊髓损伤患者上肢感觉、运动及自主神经活动变化，限制了对脊髓损伤病理生理过程、手术方法
19、和时机、新型药物、干预方式等方面的研究。因此，建立并使用与人类颈段脊髓损伤更为相近、可重复性更高的动物模型是未来的探索方向。（5）注意动物活动对恢复脊髓损伤后神经功能的作用。在设计基础研究时，要控制动物模型脊髓损伤前和损伤后的活动水平，以确保实验数据的意义和可重复性;康复训练是临床治疗脊髓损伤患者的重要环节，在基础研究中也要给脊髓损伤后动物设计规律的训练，激活动物的神经环路，在最后进行功能学评估时要注重行为学评估。2.3 加强临床研究对基础研究的支撑脊髓损伤患者流行病学调查可以明确遗传因素和环境因素与病情轻重和治疗效果的关系，有助于深入了解脊髓损伤的发生机制和病理生理过程，为基础研究提供线索和
20、思路。鉴于现有脊髓损伤流行病学调查方法的缺陷，笔者就此提出以下改进建议：(1)在开展脊髓损伤流行病学调查时，应考虑医院病案系统对患者信息涵盖不全的因素，通过标准数据结构及科学抽样方法进行研究，使最终数据更加接近真实数据；(2)在全国范围内建立创伤信息登记系统，完善系统录入数据内容，规范各项创伤性疾病登记标准和诊断要求，使数据更准确和真实；(3)利用现代化网络技术，制订脊髓损伤患者信息记录专用应用程序，整合事故监测、死亡记录、门急诊等多系统数据,补全病案系统遗漏数据t4)完善脊髓损伤后长期随访系统，对患者死因进行系统分类来评估脊髓损伤患者的长期病死率，并通过总病死率明确各种因素与死亡风险之间的关
21、系。为更好开展我国脊髓损伤人群队列研究，笔者建议重点关注如下细节：(1)除基本临床资料外，还应收集脊髓损伤患者的影像学资料、实验室检查数据、神经行为学测试结果、经济情况和心理状态等信息；（2）建立全国脊髓损伤人群队列研究机构、合作组织或研究团队之间的交流合作网络，开展多中心研究，为脊髓损伤人群队列研究提供更具说服力的证据；（3）利用信息化手段和互联网+技术架构开源大数据平台，形成医院社区患者三方数据供给源，加速脊髓损伤人群队列研究进程，提高研究的质量和效率；（4）政府和各类机构增加对脊髓损伤人群队列研究的资金投入，建立该领域的人才培养计划，拓展研究区域，鼓励开展创新性研究。通过对生物样本库中患
22、者样本的基因组、转录组、蛋白质组等多维度分析，研究人员不仅可以探究不同脊髓损伤患者相关基因和蛋白质表达方面的差异，还能寻找有价值的治疗靶点并开展系统研究，揭示其潜在的作用机制，为药物研发提供重要支持。针对脊髓损伤患者生物样本库的建立，笔者提出如下建议：（1）构建网络化的多中心生物样本库。通过信息化管理平台实现样本资源管理的数字化，不仅有利于提高生物信息利用度，也可提高管理效率。（2）建立高通量、标准化的生物样本库。通过采用统一的管理和技术规范，实现不同来源临床样本资源的标准化及可兼容性。（3）生物样本资源共享。目前，脊髓损伤标本的收集和使用常常各自为政，今后应保证生物样本状态的一致性，并利用样
23、本数据库信息管理平台实现样本信息数字化及远程共享。江苏省仍缺乏系统的脊髓损伤流行病学数据及标准化、可共享的生物样本库。为弥补这一空白，同时为建立南京医科大学脊柱脊髓疾病研究中心打下基础，由江苏省医师协会、南京医科大学和南京医科大学第一附属医院联合牵头，统一采集江苏省内各级医院的脊髓损伤患者数据，并按统一标准收集血液和脑脊液。本次流行病学调查历时近3个月，覆盖江苏省各级医院共59家，通过后期数据处理，剔除重复患者数据，最大限度保证数据的真实性和完整性。该调查还建立了一套患者数据统计系统，全面分析患者伤后接受治疗的相关信息，再根据患者脊髓损伤程度、后续功能恢复状况及病死率等评估不同因素对患者整体病
24、程的影响。除南京中心外，已挂牌成立多个分中心，按统一标准建立脊髓损伤生物样本库，通过信息化管理平台，实现统一管理、数据共享。本次江苏省脊髓损伤流行病学调查及生物样本库的建立有助于实现对脊髓损伤病情、病程、临床决策与疗效的精准评估，实现全省脊柱脊髓损伤基础研究与临床诊治联网，逐步辐射长三角地区，进一步在全国范围内推广。03总结与展望脊髓损伤的基础研究和临床研究已开展多年，但部分研究无法准确地揭示脊髓损伤后微环境的变化，也无法将基础研究中有重要意义的研究成果及a时、有效地转化为临床的治疗手段，这使得脊髓损伤的临床救治效果仍不理想。笔者针对脊髓损伤基础研究存在的不足和基础研究与临床转化的关系，提出深入解析微环境紊乱的时空异质性、建立与人脊髓损伤相近且重复性高的动物模型、改进基础研究的实验设计、建立和完善我国的脊髓损伤流行病学调查和随访体系、做好长期且有实际意义的临床队列研究及建立可共享的标准化脊髓损伤生物样本库。然而，基础研究与临床应用转化之间尚有很多环节需要解决，比如实验技术的质量控制和标准化，选择客观、准确的疗效替代指标，建立基于患者个体差异的精准诊治新策略等19o笔者相信，随着医疗和科研技术的进步，以及我国政府、各科研院所对脊髓损伤研究的重视，脊髓损伤的研究水平将得到显著提升，最终造福于患者。
