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1、枯草杆菌发酵动力学与碱性磷酸酶反应动力学研究,一实验目的,1.掌握细胞反应动力学的研究方法；2.巩固还原糖和生物量的测定原理与方法；3.掌握酶反应速度的实验测定方法；4.掌握最大反应速度rmax和米氏常数Km的测定方法。,二实验原理,对细胞反应：,实验可得不同t的底物浓度Cs值和Cx值(细胞浓度)。要求动力学参数KS，max；必求，,测定时间区间t内细胞浓度平均值。,碱性磷酸酶碱性条件下，催化磷酸单酯水解。根据酶催化反应机理：,可推导出米氏方程：,通过测定不同底物浓度CS下的反应速度r，可确定rmax和Km。,在510nm波长处比色测定OD值，从而计算出酶的活性（反应速度r）。,+Na2HPO
2、4,+H2O,碱性磷酸酶,一定pH、T,催化反应：,醌类化合物（红色）,+AAP,铁氰化钾,OH,三菌种、培养基、实验试剂和主要仪器,1枯草芽孢杆菌AS1.3982Tris-培养基：葡萄糖0.4%；NaCl0.5%；（NH4）2SO41%；KCl0.1%；CaCl20.1mmol/L；MgCl21mmol/L；Na2HPO420mol/L；酪蛋白水解物0.1%，溶于0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）中。分装于150ml三角瓶中，每瓶装50ml，于115，灭菌30min，冷却。（周二下午做)30.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）40.1mol/L pH8.8Tr
3、is-醋酸缓冲液 540mmol/L底物溶液 60.5mol/L氢氧化钠溶液 70.3%（W/V）4-氨基安替比林（AAP）溶液 80.5%（W/V）铁氰化钾溶液 93,5二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)101mg/ml葡萄糖标准液 11.甲苯12移液管，刻度试管，容量瓶，滤纸，三角瓶，布式漏斗，电子天平，恒温水浴槽，摇床，干燥箱，721分光光度计，灭菌锅，冰箱。,四实验方法与步骤,1.种子液制备（以班为单位）枯草杆菌在固体斜面培养基上活化后。接入8个装有50ml Tris-培养基的150ml三角瓶中，于30振荡培养18h作为种子液。（周三下午2:30做),2.发酵液制备（以组为单位）将上述培养
4、好的种子液接入10个装有50mlTris-培养基的150ml三角瓶中，接种量5（v：v），于37振荡培养0h、1h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5 h、5 h、5.5h(发酵到上述每一定时间取一瓶，测定发酵液的残糖含量和生物量，测定原理与方法见附录一，二)。,表1 发酵动力学实验数据,3枯草杆菌碱性磷酸酶酶液的制备,取种子液2瓶，分别加入甲苯（甲苯与种子液体积比1：20）（加一滴甲苯/1ml培养液），摇匀，37保温30min，制成酶液备用。,酶促反应动力学的研究,反应前：,反应后：,酶活力（单位）=OD5101000=（OD510反应后OD510反应前）1000,r即为酶活力。,
5、底物浓度对酶反应速度的影响rmax和Km的测定,取13支试管，编号，按下表准确操作。以空白管调零点，在510nm波长处比色测定A510nm。,五实验结果,1.发酵动力学确定,发酵实验数据处理,做,确定max与Ks。进而确定发酵动力学。,2.底物浓度对酶反应速度的影响rmax和Km的测定,酶反应实验数据处理,在坐标纸上做1/r1/CS 图，由此求Km和rmax值。,3,5二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖,附录一,一原理,在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，在 540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线便可求出还原糖的量。,二试剂,1.3,5二硝基水杨酸试剂(DNS试
6、剂)2.1mg/ml葡萄糖标准液,取7支25ml刻度试管，编号，按下表操作。,二.制作标准曲线,将上述各管溶液混匀后，在540nm波长下，用空白管溶液调零，测定吸光度值。以光密度值为横坐标，以葡萄糖毫克数为纵坐标，绘制标准曲线。,取10支试管为例，按表操作。将各管混匀后，测定各管的光密度。用制作标准曲线中的空白管溶液调零。,三.测糖,残糖浓度(mg/ml)=还原糖毫克数/0.3,在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出发酵液残糖浓度。,菌体量(CX)的测定：,附录二,生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。本实验两组采用比浊法，两组采用直接称重法。,比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测
7、定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与光密度成正比，所以可用比色计测定菌液的光密度(OD值)表示样品菌液浓度。具体操作：将培养0 h、1h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5 h、5 h、5.5 h的菌悬液摇匀后，于560nm波长下，测定0D值作为CX。用未接种的培养基作空白对照。,1.比浊法,此法分为湿重法和干重法。干重法系单位体积培养物经过滤（或离心）后，在105烘箱中烘干至恒重（11.5hr），冷却至室温称重。具体操作：先称取干燥的滤纸重量，记为W1（g），取发酵液过滤，上清液保存于冰箱进行糖浓度测定，菌体和滤纸一起于105烘至恒重后称滤纸和菌体重量，记为W2（g），根据下式计算菌体生物量，单位 g/L。,2.直接称重法,1 郭勇编著，现代生化技术.广州：华南理工大学出版社，20012 程国华编著，生物化学实验技术.沈阳：沈阳农业大学，1998,六.参考文献,再见,
