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1、免疫学技术和临床,美国贝克曼库尔特公司免疫产品市场部洪军 2007.4 安徽,内容摘要,什么是免疫分析的表现免疫分析的基本概念如何去设计一个免疫分析试剂免疫分析对临床意义的改变Access2 介绍,什么是免疫分析的表现,免疫检测的分析表现,准确性精密度灵敏度特异性,检测线性范围试剂稳定性定标周期开瓶效期,免疫分析检测的临床表现,临床灵敏度和特异性是分析结果准确性的临床表现:,理想状态,健康人群,疾病人群,灵敏度 100%特异性 60%,特异性 100%灵敏度 50%,灵敏度增加 特异性增加,假阴性 假阳性Cut-off,设置cutoff值在此处用于筛查分析,设置cutoff值在此处减少错误诊断
2、带来的高花费,设置cutoff值在此处为了最少化错误结果,关于分析试剂的检测灵敏度的定义,分析及功能灵敏度分析灵敏度(Analytical Sensitivity)使用A点标准品分析内的测试最低可辨别0值的功能分析试剂的理论上的极限功能灵敏度(Functional Sensitivity)一系列不同厚度的标准品分析间的测试,用20%的CV值来分用来描述分析的临床表现用人血清分析多于20天,且用多个试剂批号和仪器,分析表现特点:正常人群参考值和10%CV（功能灵敏度）,免疫分析的基本概念,免疫分析的经典定义,免疫分析（Immunoassay）是一种技术用于检测和/或定量,通过一个特殊的只能和被分
3、析物结合的抗体,免疫学测定的中心问题,作为免疫反应，抗原抗体的选择是整个免疫分析特异性和总体表现的关键如何选择好一个抗体去检测一个被检物质，而不与非常相似结构的其它物质有交叉反应，或漏掉须反应的物质，这是分析设计的重中之重抗体的量必须恰当，过多会引起复合物的溶解,关于抗体的亲合力,抗体除了要求纯度外（单价特异性）还必须要求亲合力，效价指抗体的量，亲合力指抗体的质在非竞争免疫反应的方式中抗体亲和力比标记物的最低检测极限更能影响分析的灵敏度在竞争法免疫反应的方式中抗体亲和力直接关系到竞争的结果对于样品中的干扰物质,亲合力影响分析的抗干扰的能力,免疫分析的工作定义,免疫分析(Immunoassay)
4、是一种测试方式,使用特殊的抗体与被检测物质的结合,此被检测物质不能通过简单的化学方法所容易检测到的.通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（labeling）的物质,常标记在抗体上通常会有一个分离（separation）的过程在最后读取信号前总是需要去仔细关注一下分析的方式（format）,Access 的技术,免疫分析-“what检测技术 化学发光 分离技术 磁性颗粒 分析方式 灵活,-“how,分析方式,检测技术,分离技术,检测技术,免疫分析检测技术(Detection)有许多可用的方法 应用一些“标记物 所产生的一些能量进行测定标记物可以或可以不被激活而产生能量通过一些相应的检测器对标记物
5、产生的能量进行测定分离技术 分析方式,放射免疫分析(Radioimmunoassay),优势优秀的灵敏度较宽的检测线性范围局限性标记物的半衰期短试剂效期短检测结果的重现性差每次检测都要做标准曲线分析的反应时间长，半天2天发射性污染有害很难实现自动化检测,荧光,荧光素(Fluorophores)FIA，DELFIA原理荧光底物,4-MUP，或荧光标记物，镧系元素Eu3+,Tb3+,Sm3+吸收光为一个短波长的光，而发射光为一个长波长的光通过荧光计检测优势与RIA具有相似的灵敏度和检测线性范围避免了RIA对危害污染物处理的麻烦和半衰期短的问题局限性可能会有来自样品中的一些自身荧光物质或短寿命的荧光
6、物质的干扰需用空白对照，速率法或推迟读数来克服,酵-颜色的变化,酵(Enzymes)-EIA原理在免疫分析结束后通过催化所加入的酵底物典型的催化反应包括颜色的变化,用分光光度计进行检测优势非常容易使用的技术用于一些定性的分析局限性对定量分析所要求的灵敏度和宽线性难以实现ELISA技术必须每次定标试剂部分成分要复溶重组反应时间较长,化学发光,化学发光物质-CLEIA原理不稳定的分子通过加入一些化学基团变得很稳定,而移去这些起稳定作用的化学基团后,分子结构变得不稳定发出光（pH的改变，酵切作用，电激发等）优势 具备RIA所拥有的优势(灵敏度和宽线性),但排除其缺点用一个简单的光度计读数非常低的背景
7、干扰类型 闪烁(flash),持续(glow)发光发光物质的稳定性水溶液中的稳定性,化学发光物质,AMPPD,Dioxetane(Lumi-Phos 530TM)-最稳定的化学发光物质（第三代）第一代：鲁米那第二代：丫啶酯类，三联 啶钌代表性分析系统贝克曼库尔特-Access/Access 2/DxI800终点读数,更稳定,ACCESS化学发光标记物的特点,很宽的检测线性范围可检测到6个数量级(例如:1-100,000 units)极高的灵敏度可检测到小到10-21 摩尔/升很底的背景干扰对于一些超敏分析项目,有相当接近零值的背景信号更超强的试剂稳定性试剂效期开瓶效期定标周期,分离技术,免疫分
8、析检测技术分离技术(Separation)有很多方式典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除 分析方式,技术的创新,磁颗粒包被技术,磁颗粒抗体包被技术磁颗粒均匀的悬浮于整个反应体系分析物在磁颗粒表面捕获磁颗粒在磁场中被清洗磁颗粒重新悬浮十分容易优势快速的反应动力学较少的样品量提高检测的灵敏度极好的批内重显性可以探针取放，实现自动化,分析方式,免疫分析检测技术分离技术 分析方式-有很多种方式可定义为分析的“处方设置一个最优化的方式(可变量)去最优化项目的临床应用,分析方式,可变量夹心法(Sandwich)vs.竞争法(competitive)标记物的放置同步(Simul
9、taneous)vs.分步(sequential)试剂/样品加入的顺序孵育的次数(步骤)清洗分离的次数(步骤)试剂/样品的体积/厚度孵育的时间孵育的温度,Access 的分析方式,基本分析方式夹心法(Sandwich)竞争结合(Competitive binding)试剂的加入，孵育和清洗 同步(Simultaneous)(1步,1次清洗)分步(Sequential)(2步,2次清洗)“Piggyback(2步,1次清洗),夹心法分析方式,捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体(labeled antibody)每个不同的抗体可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇分
10、析更特异因为二个抗体同时反应适合于检测大分子物质,bhCG TSHIgEProlactinFSH LH FerritinHBsAg,竞争法分析方式,只有捕捉抗体主要针对小分子物质检测 没有足够表面积的分析物去符合“夹心法 要求,T3FT3 B12 Digoxin ProgesteroneT4 FT4 Folate Cortisol Estradiol,如何去设计一个免疫分析试剂,一个免疫分析项目的诞生,里程碑(Milestones)市场调研确定需求项目的详细特点要求确定分析方式研发和优化证明分析表现符合项目的详细特点要求(beta sites,clinical studies)提交注册,项目临
11、床应用的要求,临床应用(claims)筛查（Screening）检测（Detection）诊断（Diagnosis）分层（Staging）预后（Prognosis）监测（Monitoring）,项目的临床应用与分析表现,必须到达的分析表现特徵灵敏度（Sensitivity）特异性（Specificity）精密度（Precision）线性范围（Dynamic range）其它,分析方式的选择,需考虑的因素分析物的特徵体积（竞争法还是夹心法）厚度（一步法，二步法，反应时间等）潜在的“钩状效应（hook effect）-假阴性解决的方法可以使用2步法方式样品量和试剂量的平衡抗干扰能力仪器的能力局限性
12、预处理的要求,试剂原材料的选择,原材料抗体标准品封闭试剂（稀释液）清洗缓冲液,Y,Y,Y,Y,Y,抗体的选择,单克隆(Monoclonal)和多克隆(polyclonal)选择的标准(criteria)特异性(Specificity)灵敏度(Sensitivity)供应能力(Supply)相关性(Correlation)可制造性(Manufacturability)花费(Cost),多克隆抗体(Polyclonal Antibodies),免疫动物获得,如羊或兔 时间长,复杂的制作流程注射,监测滴度(可能反覆注射)周期性的抽血获得特徵化(Characterization)和纯化(purific
13、ation)生产出鸡尾酒式的抗体,针对所有抗原决定簇适合对临床灵敏度要求较高分析测试,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,单克隆抗体(Monoclonal antibodies),克隆的结果抗体的产生具有高度的同源性和特异性并针对一个抗原决定簇可以选择最好的抗体在大量生产时可以确保持续的供应适合对临床特异性和批间一致性要求较高的分析测试,抗体的选择,筛选抗体需经过灵敏度，特异性和稳定性的评价许多的抗原决定簇并非一种分子所独有被测抗原的稳定性不同被测抗原的游离和结合方式,案例:hLH 抗原位点图,Beta,Alpha,B-D 1hTSHhCG,B-D 2hCG,A-D 1
14、hCGhFSHhTSH,B-D 3,A-D 3,A-D 2hCGhFSHhTSH,案例:Troponin-I 抗原位点图,肌钙蛋白-I稳定性的问题氧化的问题磷酸化的问题,N-terminal,C-terminal,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190,200,P,O,O,_,_,Access 1st Gen,31-34,58-70(cross-react),157-160,PMP,Detect,Access AccuTnI,_,_,24-40,41-49,PMP,Detect,抗体的选择,等分子
15、(Equimolar)vs.非等分子(non-equimolar)分析依赖于特异性抗体的选择,结合方式-一些位点被隐藏,游离方式-所有位点都暴露,PSA,ACT,PSA,嗜异性抗体(Heterophile Antibody),病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体(通常是鼠或羊)来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗分析的干扰可以在双单克隆夹心法分析方式中引起假阳性可以在单克隆/多克隆分析方式中出现假阴性,嗜异性抗体反应,假阳性 较多见嗜异性抗体在捕捉抗体和检测抗体中搭桥,出现在双单克隆夹心法方式中,嗜异性抗体反应,假阴性 较少见嗜异性抗体争夺捕捉或检测抗体的抗原结合位点,出现
16、在单克隆/多克隆分析方式中,稀释液,封闭剂（稀释液）可以加在反应基质中或整合在试剂盒内动物蛋白（鼠，兔，羊等）各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！,定标程序,厂家产生的主定标曲线感觉节省的校正型 2 点定标会增加定标的频率对非线性的标准曲线可能会有问题(大多数的免疫分析产生的是非线性的标准曲线)多点定标曲线定量 典型的是6个水平,定性 典型的是2个水平可以达到最大的灵敏度,准确性和精密度可以有更长的定标周期间隔,标准品 参比物,参比物纯化蛋白(Purified protein)通常制作较便宜相对较短的稳定时间,需特殊的存放条件一般需要冻干存贮可能会有批间的不一
17、致性重组(Recombinant)相对昂贵很长的研发时间更稳定和可靠可以以液体的方式供应,分析清洗液,清洗液使用的类型和量，在清洗步骤结束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗残留的有效去除能力等，都会影响到分析表现清洗液中加入适当的表面活性剂可以去除不需要的生物活性物质(干扰物质),免疫反应中不能用水进行分析内的清洗分离!,试剂的优化,需优化参数时间程序步骤各类试剂厚度pH/离子强度需优化的内容扩散的速率结合的速率复合物的稳定性,优化后达到的表现灵敏度(Sensitivity)精密度(Precision)线性范围(Dynamic range)准确性(Accuracy)相关性(Correlat
18、ion),试验设计选择对临床检测结果的影响,临床试验结果反映了试验过程中各种条件的优化,免疫分析设计及优化,开发免疫分析试剂盒的过程就是选择并优化各种实验条件，达到预期结果并能准确反应临床真实情况的过程,抗原/抗体,分析方式,分离技术,检测技术,总体分析表现,Beckman Access AccuTn-I,符合NABC/IFCC/ESC/ACC的导则要求最好的99%分位值的比值没有嗜异性抗体,HAMA和RF的干扰对样品没有抗凝剂（肝素）的要求周转时间(TAT)小于30分钟(12分钟)最宽的检测线性范围最长的定标稳定时间最多的临床应用诊断危险分层（高灵敏度和精密度）治疗监测,为什么贝克曼有如此好
19、的结果表现呢？,心肌钙蛋白和心脏疾病,cTnI的水平已用于AMI的诊断,但随着诊断检测技术的提高cTnI可对病人的短期和长期的心血管事件的风险进行预期,免疫分析的未来,过去症状的处理没有标准的准则,现在标准化的诊断和治疗的步骤减少操作的可变性 和不依从性着重单个个体,明天人群疾病的花费和因果关系确认一些医学措施所带来的益处风险评估教育项目预防发病率,展望控制发病率(控制你因某病而死亡),紧急监护,疾病管理,人群健康管理,更有效合理的管理,疾病的有效管理已成为卫生保健系统机制改变的基石，同样的将推动所有的决定和因此而产生的行动。,Access 2R 免疫分析系统,产品特点和优势,产品特点,连续，随机和急诊运行方式机上冰箱，即用型试剂，覆膜技术24个试剂位/1200测试60 样品位(原试管或样品杯)检测速度最高可达100 测试/小时最高可达56天上机/定标稳定时间 3 小时离机时间出结果时间最快为12分钟吸样针超声波液面感应，清洗和混匀自动跟踪试剂盒消耗品用量第三代化学发光免疫分析技术灵活的免疫分析方式3步旋转缓冲液冲洗微粒子进行分离中文操作系统,谢谢,
