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1、,Mathematical Biosciences Institute(Ohio State Univ),2 October 2003,Chapter 11 Cell cycle,1 introduction of the cell cycle,由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，叫细胞周期。分为4个期：G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间。S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期。G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。,2001 N
2、obel Prize,Leland H.Hartwell 1970s“Checkpoint”Yeast genetics100 CDC genesStart gene,Tim Hunt 1980sCyclinsSea Urchins,Paul M.Nurse1970sCDKsyeast,2 MPF(M phase promoting factor),Cyclin,CDK,2.1 MPF found,2.2 MPF components,Cyclin(B),CDK(cyclin dependent kinase),1970s Rao和Johnson发现与M期细胞(Hela)融合的间期细胞染色体发
3、生凝缩，称为早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。G1期PCC为单线状，因DNA未复制。S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。,G1 phase fuse with M phase,2.1 MPF found,s phase fuse with M phase,G2 phase fuse with M phase,MPF
4、,Manfred Lohka and Jim Maller(UCHSC)-used cell free assay to purify MPF-tested various cytosolic fractions for MPF activityMPF is a 2 subunit protein kinase-32 kDa and 45 kDa,MPF,Cdk,History of MPF,PCC,M-phase,Trigger,MPF,P32 and P45,kinase 非洲爪蟾(1988),Cdc gene found in yeast P34cdc2 trigger G2/M P34
5、cdc2 bind with P56cdc13 active,Cyclin found in urchin,key factorFor M-phase(1983),MPF include Cdk and cyclin,p32=P34cdc2=CDKP45=P56cdc13=cyclin B,2.2 Cyclin,1983 first foundG1-phase:cyclin C,cyclin D,cyclin E Cln1,Cln2,Cln3(Yeast)M-phase:cyclin A,cyclin B,Comparatively stable,A2,Destroy box,Cyclin b
6、ox,B1,PEST,G1 cyclin renewal,C,Different Cyclin expressed in different cell cycle phaseBind with Different CDK,regulate CDK kinase activity,特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。,Regulation of mitotic cyclin levels in cycling cells.,MPF regulation was elucidated by Tim Hunts discove
7、ry of Cyclins,2.3 CDK Cyclin depend kinase,CDKI,CDK kinase domain,Cdk1=cdc2Cdk3cdk8,细胞周期控制,细胞周期检验点（check point）,组成：感受器、信号传导通路、效应器。主要检验点：G1/S检验点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)。S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？中-后期检验点：纺锤体组装检验点。六、细胞周期检验点（check point）,3.1 T
8、he G1/S Checkpoint,环境因素生长因子内部因素DNA 损伤,G1 cyclin D(D1,D2,D3),E,AG1 CDK,CDK2,4,6cyclin D+CDK4,6cyclin E,A+CDK2cyclin D(D1,D2,D3)is key factor for G1/Scyclin E is key factor for startup s-phaseG1 周期蛋白通过泛素结合PEST 降解,Oringin recognition complex,复制起始复合物Orc1-6DNA replication-licensing factor theoryMinichrom
9、osome maintenance protein,Mcm2-7,3.2 S/G2/M,阻止DNA未完全复制时启动M期只有DNA复制正确完成，方可启动未复制完成的DNA会释放一些信号。导致细胞周期运转受阻 CDC25 活性低但 Wee1 活性高，MPF不能活化,MPF inactivate,3.3 M-phase regulation,MPF activateM phase checkpoint,MPF&the G2 Checkpoint,MPF-pushes cell past G2 checkpoint,Thr 161,Tyr14,15,P,MPF活化,M期CDK的激活起始于分裂期cycl
10、in的积累。结合cyclin B的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivating kinase CAK)的作用下完成的。,Tyr 15Inhibitory:Added byWee1Removed by Cdc25,Thr 160Activating:CDK adds afterCyclin binding,cyclinB+CDK,inactive,Wee1/mik1 and CDK Ki
11、naseActive CDK 14,15 amic acid,Inactive pre-MPF,CDK 160+p,14.15-p,Cdc25c,Wee1/mik1,CDK Kinase,MPF induces multiple nuclear and cytoplasmic changes at the onset of M phase,both by activating other protein kinases and by phosphorylating proteins such as condensins and the nuclear lamins.,M phase check
12、point:检验染色体是否连接到纺锤体上,后期促进复合物APC与M期调控,APC:Anaphase Promoting ComplexM期 向后期转换依赖严格调控 APC1-8APC 调控 Cyclin B 和其他蛋白泛素化降解纺崔体装配检验点控制 APC 活性,Mad2,Cdc20,周期蛋白降解,瑞典皇家科学院6日宣布，将2004年诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆赫什科和美国科学家欧文罗斯，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解。其实他们的成果就是发现了一种蛋白质“死亡”的重要机理,死亡之吻,Protein degradation,Need not energy,only n
13、eed enzyme,Need energy,certain time,certain position and certain direction protein degradation,一种被称为泛素的多肽在需要能量的蛋白质降解过程中扮演着重要角色。这种多肽由76个氨基酸组成，它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。它就像标签一样，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”，在那里被降解。,Polyubiquitination of mitotic cyclins,原来细胞中存在着E1、E2和E3三种酶，它们各有分工。E1负责激活泛素分子。泛素分子被激活后就被运送到E2上，E2负责把泛
14、素分子绑在需要降解的蛋白质上。但E2并不认识指定的蛋白质，这就需要E3帮助。E3具有辨认指定蛋白质的功能。当E2携带着泛素分子在E3的指引下接近指定蛋白质时，E2就把泛素分子绑在指定蛋白质上。这一过程不断重复，指定蛋白质上就被绑了一批泛素分子。,High Energy Thioester Bond,can be transferred from E1 to E2,E3,or substrate,Ubiquitin is Transferred via Thioester Bonds,Mitotic Cyclins are Destroyed by Ubiquitin-Dependent Pro
15、teolysis,proteosome,Summary,4 Model of cell cycle,Yeast Size and Morphology Through the Cell CycleThe stages of mitosis and cytokinesis in an animal cell.,Budding yeast,The stages of mitosis and cytokinesis in an animal cell.,5 cell cycle check methods,细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关。通常G1期持续时间差异较大，M期最短约0.54.5小时
16、。标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为3H或者14C标记的TDR。,5.1细胞周期时间的测定,细胞周期同步化,细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化（一）自然同步化 1、多核体：如：粘菌、疟原虫。2、某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。3、增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。,人工同步化,1、选择同步化 1
17、）有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%）。2）细胞沉降分离法：M期细胞体积大，可用离心分离。优点：可用于任何悬浮培养的细胞。缺点：同步化程度较低。,2、诱导同步化 1）DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法：在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR（Hela 2mol/L；CHO 7.5mol/L）。S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TDR，释放时间大于TS时，再次加入过量TDR。优点：同步化程度高 缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。2）中期阻断法 用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。,
