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1、第十四章 遗传物质的改变（二）基因突变,Aside from chromosomal mutations,the major basis of diversity among organisms,even those that are closely related,is genetic variation at the level of the gene.The origins of such variation are gene mutations,whereby coding sequences are altered as a result of substitution,additi
2、on,or deletion of one or more bases within those sequences.,第一节 基因突变的概说,突变（mutation）是指遗传物质内所发生的可遗传的变异。是自然界产生变异的主要来源，是生物进化的源泉。突变类型：基因突变和染色体畸变。基因突变概念：是指基因内部的改变，也就是染色体上一定位点化学结构的改变，故又称点突变（genic or point mutations）。,基因突变的特点：1.突变率相对稳定：高等动物10-510-8；细菌10-410-10。2.突变的多向性。3.突变的重演性：同种生物中，同一基因突变可以重复地发生，也即同种生物中相
3、同基因的突变可以重复地出现。4.突变的可逆性：基因突变是可逆的。基因突变的可逆性，是区别基因重组和染色体畸变的特点之一，因为畸变的类型一般是不能恢复的。5.突变的有害性与有利性：突变对生物体来说，绝大多数是不利的，但又是必需的，它提供了适应新环境的潜在因素。,从突变的发生上突变可分为：自发突变在自然情况下产生的；诱发突变-人们有意识地应用一些物理、化学因素诱发的。,从突变体的表型特性上，突变可分为：,（1）形态突变（2）生化突变（3）致死突变（4）条件致死突变,（1）形态突变：突变主要影响生物的形态结构，导致形状.大小.色泽等的改变.例:安康羊四肢很短。（2）生化突变：突变主要影响生物的代谢过
4、程，导致一个特定的生化功能的改变或丧失。可以对正常个体与变异个体的生化特性研究以分析基因的作用机制。例：链孢霉的营养缺陷类型。,生化突变,野生型(wild type)与原养型(prototroph)野生型是指存在于自然界中没有经过基因突变，具有正常生化代谢功能的遗传类型；原养型指具有与野生型相同营养需求与表现的遗传类型，有时特指突变型恢复为与野生型相同的个体。营养缺陷型(auxotroph)因基因突变丧失了某种生活物质合成能力，在基本培养基上不能正常生长，需加入相应营养成分的突变型。,红色面包霉的生化突变型,野生型红色面包霉能在基本培养基上正常生长。几种生化突变型：突变型a：精氨酸(精氨酸合成
5、缺陷型)；突变型c：精氨酸或瓜氨酸(瓜氨酸合成缺陷型)；突变型o：精氨酸、瓜氨酸或鸟氨酸(鸟氨酸合成缺陷型)。研究表明，精氨酸是蛋白质合成的必需氨基酸，而其合成途径为：,（3）致死突变：突变主要影响生活力，发生突变后会导致特定基因型个体死亡的基因突变。,大多数致死突变都为隐性致死，突变后代中的隐性纯合体表现为致死的效应。如：小鼠毛色遗传的隐性致死突变；植物隐性白化突变。少数致死突变表现为显性致死，带有突变基因的个体都会死亡。如：人的神经胶症基因。如果致死突变发生在性染色体上，将产生伴性致死现象。,小鼠毛色遗传的隐性致死突变,在正常黑色鼠中发现一种黄色突变型，杂合体(黄色)自群交配、杂合体与黑色
6、鼠交配结果如下图所示。研究表明：黄色基因(AY)在毛色上表现为显性，但是同时具有隐性纯合致死效应；AYAY个体胚胎阶段即死亡，所以杂合体自群交配毛色会表现2:1。,植物隐性白化突变,与叶绿体形成有关的基因多达50多对，其中不少基因突变(丧失功能)均可能导致叶绿素不能形成，产生白化苗。白化苗不能进行光合作用，子叶或胚乳中养料耗尽时，幼苗就死亡。,在某些条件下能成活，而在另一些条件下致死。例:噬菌体T4的温度敏感突变型在25 时能在E.coli宿主中生存,而在42 时则不能。,（4）条件致死突变,突变发生的时期,生物个体发育的任何时期均可发生：性细胞(突变)突变配子后代个体；体细胞(突变)突变体细
7、胞组织器官2.性细胞的突变频率比体细胞高：性母细胞与性细胞对环境因素更为敏感。3.(等位)基因突变常常是独立发生的：某一基因位点发生并不影响其等位基因，一对等位基因同时发生的概率非常小(突变率的平方)。4.突变时期不同，其表现也不相同：突变可发生在个体发育的任何时期。一般来说，突变发生的时期愈迟，生物体表现突变的部分愈少。例金银眼猫：一个眼睛是黄褐色，另一个眼睛是蓝色。,突变率,在正常的生长条件和环境下，突变率往往是很低的。,突变的可逆性,突变的重演性：同一突变可以在生物的不同个体上多次发生。同一基因突变在不同的个体上均可能发生；不同群体中发生同一基因突变的频率相近。,突变的可逆性：基因突变的
8、发生方向是可逆的。正突变(forward mutation)：显性基因A隐性基因a；反突变(reverse mutation)：隐性基因a显性基因A。通常认为：野生型基因是正常、有功能基因；而最初基因突变往往是野生型基因突变而丧失功能、发生功能改变，表现为隐性基因。所以反突变又称为回复突变(back mutaiton)。通常用u表示正突变频率、v表示反突变频率，则：正突变uA=a 反突变v,正突变与反突变发生的频率一般都不相同。多数情况下：正突变率总是高于反突变率。原因在于：正常野生型基因内部存在许多可突变部位，其中之一结构改变均会导致其功能改变；但是一旦突变发生，要回复正常野生型功能则只能由
9、原来发生突变的部位恢复原状。因此，基因突变一般不是由于基因物质的丧失，而主要是组成基因的物质发生了化学性质变化所致。,突变的多方向性与复等位基因,突变的多方向性：指基因突变可以多方向发生，即基因内部多个突变部位分别改变后会产生多种等位基因形式。例如：A基因不同部位发生改变产生突变基因a1、a2、a3等对A均表现为隐性的基因。新基因可能均是无功能的，也可能各具不同功能。复等位基因(multiple allele)：由于基因突变多方向性而在同一基因位点上可能具有的多种等位基因形式。在二倍体与异源多倍体中，同一位点只能有一对基因，最多存在两种等位基因形式；因此复等位基因的各种形式会存在于生物群体的不
10、同个体中。,自发突变的原因,（1）物理因素：太阳的辐射，自然界的射线，紫外线，电流，高温，超声波，激光等。（2）化学因素：秋水仙碱，芥子油，咖啡碱，甲醛，脱氨剂，烷化剂，亚硝酸等。（3）生物因素：在生物的新陈代谢过程中，排放的生物毒素等。（例：植物种子贮存久了可引起突变率增加；从陈种子可提取出一些诱变物质；番茄种在很干燥的条件下，提高番茄细胞的渗透压，以后从它的F2、F3可以分离出多数突变体。）,三、突变发生的部位,2.体细胞突变（somatic mutation）,突变发生在体细胞中。,能传给后代。,1.生殖细胞突变（gametic mutation）,突变发生在配子或形成配子的组织中。,不
11、传给后代。,第二节 基因 突变的分子机制,一、突变的分子基础,1.碱基改变（base substitution）,（2）颠换（transversion）,嘌呤变成嘧啶 或 嘧啶变成嘌呤（A/GC/T）。,（1）转换（transition）,一种嘌呤变成另一种嘌呤（AG）；一种嘧啶变成另一种嘧啶（CT）。,2.碱基的插入或丢失（insertion or deletion）,引起移码突变（frameshift mutation）。,二、突变的分子机制,1.复制错误,是突变的基本来源。,1953年，Watson和Crick就提出DNA中的嘌呤和嘧啶存在互变异构体，与错误的碱基配对就会导致互变异构变化
12、（tautomeric shift）。,主要是由于碱基的互变异构体（tautomers）形成的碱基错配。,（1）复制错误的原因,互变异构的形式,i）酮式-烯醇式（keto-enol）互变。,ii）氨基-亚氨基（amino-imino）互变。,T,G,C,A,T,A,C,G,互变异构引起的配对错误,亚氨基形式,2.碱基类似物（base analogs）,是一类与标准碱基结构相似的碱基衍生物。,（1）5-溴尿嘧啶（5-bromouracil，5-BU）,与T结构相似。,5-BU在烯醇式（enol form）时能与G配对。,A-T,A-B,T-A,A-T,B-G,A-B,G-C,（2）2-氨基嘌呤（
13、2-amino purine，2AP）,是A的类似物。,亚氨基时可以与C配对。,2AP（amino form）,T,2AP（imino form）,C,用于AIDS（acquired immunodeficiency syndrome）病治疗的AZT（azidothymidine，叠氮胸苷）就是T的类似物，而且是反转录酶的底物（但不是复制酶的合适底物）。,3.烷化剂（alkylating agents）,可将烷基团加到核苷酸上。,（1）甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）,能给酮式G的第6位、T的第4位上加上甲基。,G甲基化后与T配对。,4.吖啶染料（acrid
14、ine dyes）,在DNA链中加入或除去一对碱基，造成移码突变（frameshift mutation）。,（1）二氨基吖啶（原黄素）（proflavin）,扁平分子，能嵌入碱基对之间，引起DNA双螺旋扭曲，复制时导致缺失或插入。,C GG C,CGGC,C GGNC,CNGGNC,5.脱嘌呤位点（apurinic site）,是指嘌呤环的9位N与脱氧核糖的1位C之间的糖苷键（glycosidic bond）断裂形成的位点。,又称AP site:,丢失一个嘧啶后的位点也称为AP site（脱嘧啶位点：apyrimidinic site）。,引起的后果：导致碱基丢失。,C GGTC,CAGGT
15、C,CGGC,6.脱氨基（deamination）,（1）亚硝酸的作用（nitrous acid，NA）,C或A被脱掉氨基后分别变成U或H（hypoxanthine，次黄嘌呤）。,C,U,NA,A,H,NA,H可与C配对。,引起的后果：引起转换。,CG,UG,UA,TA,AT,HT,HC,GC,7.紫外线和高能辐射,电磁波（electromagnetic spectrum）随着波长变短，能量增加。,（1）紫外线（ultraviolet，UV）,1934年，发现UV对果蝇卵有诱变作用。到1960年已经搞清楚它的作用机理。,UV对DNA的作用,主要是诱导形成嘧啶二聚体（pyrimidine dim
16、ers），尤其是T-T。,二聚体扭曲了DNA构像，导致复制不能进行。,T-T dimer,T-T dimer,（2）离子辐射（ionizing radiation）,1920年，Hermann J.Muller和Lewis J.Stadler发现比紫外线波长更短的X-rays、gamma rays、以及cosmic rays这些离子辐射有诱变作用。,X-ray的诱变作用的机理,产生自由基（free radicals）；打断磷酸二酯键，导致染色体断裂。,X-rays与X连锁隐性致死突变,第三节 突变的后果,一、沉默突变（silent mutation）,突变对基因组的功能并无影响。,1.基因间区
17、或非编码区突变。,2.同义突变,突变后的密码仍然编码同一个氨基酸。,二、错义突变,突变后的密码编码另一个氨基酸。,如果发生在活性部位，对蛋白质的功能有重大影响。,三、终止突变,编码氨基酸的密码突变成终止密码。导致肽链合成提前终止，产生残缺蛋白。,四、通读（read through）,终止密码突变成某个氨基酸的密码。,第四节 突变的检出：Ames test,突变可以通过多种生物系统检查。如果蝇、鼠、培养的哺乳动物细胞等。但最常用的是Ames test。,一、Ames test 的原理,是Bruce Ames1970年建立的。,化学诱变剂（mutagens）能引起DNA突变（碱基替换、移码突变等）
18、。使细菌的表型发生改变。,1.诱变（mutagenesis）,营养缺陷型,野生型,恢复突变,突变,（1）直接诱变（direct mutagenesis）,化学试剂（如EMS）或射线直接引起碱基改变或DNA断裂。,诱变剂,DNA,表型改变,诱变剂,代谢产物,化学试剂,DNA,表型改变,代谢产物,失去诱变能力,大多数化学试剂经过（肝脏）代谢作用后丧失诱变作用或获得诱变能力。,（2）间接诱变（indirect mutagenesis）,二、菌株（strains）,沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his-）。,一个his-菌株是碱基替换突变，可以通过替换突变
19、恢复成野生型。,另外三个his-菌株是不同的移码突变，可以通过移码突变恢复成野生型。,三、结果观察,his-只能在含有组氨酸的基本培养基或完全培养基中生长。如果恢复突变成野生型，就可以在基本培养基中生长。,四、实验方法,1.注射大鼠,给雄性大鼠腹腔注射芳香族化合物（如多氯联苯）诱导肝酶活性。,2.制备肝酶（S9）,4天后杀鼠取肝，捣碎离心，保留上清液（S9）。,3.待测物激活,待测的化学试剂与S9混合。,为什么？,4.突变菌株培养,与S9混合后的化学试剂再与his-菌株一起在基本培养基平板培养。,5.结果判定,如果长出菌落，说明发生了恢复突变。表明所测的化学试剂有诱变性。,除Ames test
20、外，姐妹染色单体交换（sister-chromatid exchange,SCE）、微核（micronucleus）等也是常用的诱变剂筛选（screening）方法。,Ames test,Auxotroph：营养缺陷型,对照的意义！,二、果蝇突变的检出,（一）果蝇伴性隐性致死（或非致死）的检出 ClB方法（P457）ClB品系（一条X染色体上为ClB，另一条正常）C：在X染色体上有一个大的倒位（inversion），代表Crossove suppressor,使它不能和另一同源染色体之间发生交换。L：是一个lethal recessive X-Linked gene B：Bar eye 显性棒
21、眼基因,ClB方法是让经过不同处理后受检的雄果蝇和ClB雌果蝇交配，F1 2：1，其中的半数雌蝇带ClB染色体，它的另一条X染色体则来自父本，可能带有隐性突变基因而不表现。新的隐性致死基因（l）一般也不会是l的等位基因，故这些雌蝇仍可存活。,一、果蝇性连锁突变的检出,（1）鉴别果蝇X染色体上基因的隐性突变 Muller-5技术：检出果蝇X染色体上的隐性突变特别是致死突变，这与ClB原理一样。Muller-5品系的X染色体上：B（Bar 棒眼）Wa（apricot 杏色眼）Sc(Scute,小盾片少刚毛）倒位：可抑制Mullers的X染色体,一、果蝇性连锁突变的检出,实验时，把野外采集的，或经诱
22、变处理的雄蝇，与Muller-5雌蝇交配，得到子一代后，做单对交配，看子二代的分离情况。如有致死突变，F2中没有野生型雄蝇，如有隐性的可见突变，则除Muller-5雄蝇外，出现具有可见突变的雄蝇。,图,F2：（1）若无隐性致死基因，则F2为：1：1：1：1（2）若有隐性致死基因，则F2中无野生型。（3）若有隐性可见突变，则F2雄蝇可看到突变体。,（2）果蝇常染色体上突变的检出 果蝇常染色体上的致死突变也可以被检出，但要经过三代。例如：要检出果蝇第二染色体上的突变基因 可利用平衡致死系统一条第二染色体上 显性基因Cy（curly,翻翅）纯合致死，还有一个大倒位另一条第二染色体上 显性基因S（st
23、ar,星状眼）纯合致死 Cy+Cy+S+S Cy+S 该平衡致死系统，同时又是倒位杂合体。检出过程如下：,P1331图,在子三代时：（1）如最初第2染色体上不带致死基因，则有1/3左右的野生型（2）如最初第2染色体含有致死基因，则只有翻翅果蝇（3）如最初第2染色体上会有隐性可见突变，则除翻翅果蝇外，还有1/3左右的突变型。（4）如最初第2染色体上含有半致死突变，则野生型很少。,二、链孢霉营养缺陷型突变的检出,1、菌丝过滤法（可将野生型与突变型分离）链孢霉不受青霉素的影响，但是可以用菌丝过滤法把野生型和突变型分离。野生型的孢子能在基本培养基中萌发并长成菌丝，而缺陷型则一般不萌发或不能长成菌丝。这
24、些萌发的分生孢子就可以用棉花过滤去掉，未萌发的分生孢子继续留在液体培养基中。,二、链孢霉营养缺陷型突变的检出,2、营养缺陷型突变的检出与鉴定1945年，美国遗传学家Beadle和生物化学家Tatium研究出检测链孢霉营养缺陷型突变的方法。基本根据：野生型菌株能合成一系列化合物-基本培养基上生长；缺陷型菌株 不能在基本培养基上生长;能在完全培养基上生长;能在基本培养基它所不能合成的物质-生长。（图）,二、链孢霉营养缺陷型突变的检出,这样依次分析下去，就可知道是哪种AA或哪种维生素不能合成。为了进一步确定发生的变异是由那一个基因控制的，还要将经过上述方法检出的突变型，跟不同交配型的野生型交配。看产
25、生的子囊孢子的发育，表现出来什么样的分离现象，如果表现为1：1的分离，即4个是野生型，4个是突变型，那就表明是一个基因突变。,四、人的突变的检出,1、家系分析（pedigree analysis）和出生调查 常染色体隐性突变难以检出。很可能是由于两个杂合个体的婚配，而不是由于隐性突变。显性突变的起源比较容易检出。在人类方面，突变率的估计方法之一是根据家系中有显性性状的患儿的出现。在这些家系中，祖先各代是没有这些性状的；如双亲一方也有同一遗传病，则这名患儿应除去不计。,四、人的突变的检出,例如：软骨发育不全（achondroplasia）由常染色体显性基因引起，患者四肢粗短。Mrch(1941)
26、调查，在94075活产儿中，发现10例为本病患者，其中2例的一方亲本也是本病患者，所以应该除去不计，其余8例的双亲正常，可以认为是新突变的结果。则每个基因的突变率是（102）/2（940722）4.210-5,四、人的突变的检出,下面是一个上眼睑下垂的家系，先证者的父母表型正常，说明是新产生的突变。,四、人的突变的检出,2目前用的较多的检出人类突变的另一方法，是筛选各种蛋白质或酶的微小变异：例如：镰型细胞贫血症患者基因型Hbs Hbs 血红蛋白（S）(SS)正常为 HbA HbA 血红蛋白（A）（AA)杂合体 Hbs HbA 具两种血红蛋白的A和S(AS)A与S两种血红蛋白电泳的迁移率不同，通
27、过电泳可以分辩,四、人的突变的检出,四、人的突变的检出,现已知Hbs是 6Gluval该方法的局限是并不是所有氨基酸的代换都能引起蛋白质分子电荷的变化，因此，不是所有氨基酸的改变都能用电泳检出。分子水平：RFLP、AFLP 等、基因组序列分析等。,第五节 突变的修复（repair）,原核生物和真核生物在进化中都发展了各种修复系统（repair systems）来修复DNA损伤。,一、直接修复,1.DNA polymerase修复,DNA pol都有35外切酶活性，对复制过程中的错误碱基掺入进行校正（proofreading）。,动画演示DNA修复,2.光修复（photoreactivation
28、 repair）,是对UV诱发的T-T二聚体。修复发生在320-370nm的蓝光中。,1949年Albert Kelner发现的。,（1）修复酶：,光复活酶（photoreactivation enzyme,PRE）,（2）修复机理,PRE被光子激活，直接切断T-T之间的交联键。,（3）修复过程,UV,二、切除修复（excision repair）,1964年R.R.Boyce、P.Howard-Flander小组和R.Setlow、W.Carrier小组分别发现一种不依赖光的修复暗修复。,1.核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）,（1）识别损伤处,修
29、复T-T dimer导致的结构变形。,内切酶uvrABC识别。,uvr：Ultraviolet repair,uvrABC由三个亚基组成,UvrA,UvrC,UvrB,uvrAB识别嘧啶二聚体或其他大的损伤。,然后uvrA脱离。,T-T,AA,T-T,AA,uvrA,uvrB,uvrC与uvrB结合，并在损伤点两侧（5端7nt、3端3-4nt）切断单链。,T-T,AA,uvrC,uvrB,（2）切割,（3）释放单链片断,uvrD是一种解旋酶，把切开的部位解螺旋，释放出单链片断（约12nt）。,T-T,uvrD,AA,5,3,（4）修补,DNA polymerase 填补缺口。,AA,Pol,（
30、5）连接,DNA ligase连接成完整的链。,AA,ligase,TT,NER,动画演示,T-T二聚体的切除修复,2.碱基切除修复（base excision repair,BER）,修复单个核苷酸受伤位点。,这些小的损伤位点不能被uvrABC系统识别。,（1）AP 内切酶（AP endonuclease）修复系统,AP位点（AP site）:,自发丢失或被切掉了嘌呤或嘧啶碱基的位点。（apurine/apyrimidine）,AP 内切酶:,识别DNA单链上的AP位点（失去了碱基），并能在此处切断DNA单链。,DNA糖基酶（DNA glycosylases）,识别DNA链上的错配碱基，并切
31、除碱基，产生一个AP位点。,有多种DNA糖基酶分别切除U、H等的碱基。,修复过程,i）糖基酶识别错配位点，并制造AP位点。,ii）AP内切酶切除戊糖。,iii）DNA 聚合酶修补缺口。,iv）DNA 连接酶连接缺口。,（2）GO系统,修复G由于氧化作用而产生的8-O-G（GO）。,GO：,8-氧-7,8二氢脱氧鸟嘌呤。,在复制的时候与A配对，使C-GA-T。,使细胞中的8-O-GTP 转变为8-O-GMP，而不能再成为DNA合成的原料。,8-O-GTP,8-O-GMP,mutT,mutT糖基酶,可以切除GO-A配对中的A，使GO与C配对。,C-G,C-GO,GO-A,C-G,GO-,GO-C,
32、mutY,mutY糖基酶,C,G,C,GO,C,G,A,GO,GO,C,GO,氧化损伤,复制,MutY切除A,修复,可以切除GO-C配对中的GO，使C与G配对。,C-G,C-GO,C-,C-G,mutM,mutM糖基酶,C,G,C,GO,氧化损伤,C,C,G,MutM切除GO,修复,GO系统修复方式,三、复制后修复（post-replication repair）,Miroslav Radman首先在切除修复缺陷型菌株中发现的。,1.重组修复（recombination repair）,当DNA复制的模板链上有结构变形（如嘧啶二聚体），此位点就不能充当模板。DNA复制酶只能跳过去，留下一个缺口
33、。,（1）损伤,主要是修复uvr系统未彻底清除的T-T dimer。,跳过T-T dimer复制,（2）修复过程,复制酶跳过，新链中留下缺口。,在Rec A蛋白的介导下，新链与另一条模板链发生重组交换，填补缺口。,由于单链交换而在另一条模板链上造成的缺口可通过DNA polymerase的修复作用修复。,在Rec A蛋白介导下的同源重组。,2.SOS修复（SOS repair）,又称为差错倾向修复（error prone repair）。,特点：,DNA复制时遇到损伤位点并不停下或跳过，而是继续向前复制，但并不保证碱基配对的准确性。,是一种但求保命的应急行为。,修复过程复杂，涉及lexA、re
34、cA、uvr等20多种基因产物。,3.错配修复（mismatch repair）,（1）修复系统至少应具备三个功能：,识别错配的碱基对。,能准确地区分出错配的碱基对中哪一个碱基是错误的。,A-C,A?、C?,切除错误碱基，并进行修复。,ATGCATGCATGCTACGTACGCACG,（2）dam甲基化酶,识别位点：,GATCCTAG,上的A,功能：,使这个A变成6-m-A,在修复中的作用,母链中的这个位点都被甲基化，新复制出的子链尚未被甲基化。,5,3,修复酶系统可能涉及的酶：,使修复酶系统中的成分能识别新链，把新链中的错配碱基切掉，并修复合成。,MutS（识别错配位点）、MutL（识别新合成的链）、UvrD（解开双螺旋）、MutH（切掉含有错配碱基的一段新链）、DNA pol I（修补缺口）、连接酶（连接缺缝）。,A,T,GATC,CTAG,A,C,GATC,CTAG,复制错误,非甲基化,A,GATC,CTAG,切除,新链,新链,A,GATC,CTAG,修复合成、连接,T,A,GATC,CTAG,T,新链也甲基化,
