酶分子修饰压缩.ppt

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1、第六章 酶分子修饰,教案,什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。,酶分子修饰的意义,稳定酶的天然构象保护活性部位维持酶功能结构的完整性降低酶的抗原性改变酶学性质,回本章目录,第一节 酶的化学修饰,化学修饰：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。即利用修饰剂所具有的各种化学基团特性，直接或经过一定的活化过程，与酶分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化学反应，对酶分子结构进行改造。,一、化学修饰分类,（一）酶分子主链修饰（二）酶分子侧链基团修饰（三）大分子结

2、合修饰（四）氨基酸置换修饰（五）金属离子置换修饰（六）亲和修饰,（一）酶分子主链修饰,利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。主链切断修饰主链连接修饰,1、主链切断修饰,主链切断的三种情况：活性中心破坏失活活性中心完整保持活性，改变抗原性有利于活性中心的形成显示活性或活力提高,胃蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原的激活,胰凝乳蛋白酶原的激活,2、主链连接修饰,将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或多种催化活性。,（二）酶分子侧链基团修饰,酶蛋白的侧链基团：指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。包括：氨基（-NH2）、

3、羧基（-COOH）、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。,氨基修饰,使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂修饰剂:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：赖氨酸等,常见基团的化学修饰反应：氨基,教案,羧基修饰剂,可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物称为羧基修饰剂。修饰剂:碳化二亚胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸等,常见基团的化学修饰反应：羧基,教案,巯基修饰剂,两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯基具有很强的亲核性，巯基一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐等,常见基团

4、的化学修饰反应：巯基,教案,胍基修饰剂,精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰，而一些二羰基化合物能够在中性或弱碱性条件下与精氨酸反应，目前关于精氨酸的修饰的研究主要集中在二羰基化合物上。,常见基团的化学修饰反应：胍基,教案,酚基修饰剂,蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。修饰方法：碘化法、硝化法等修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。,常见基团的化学修饰反应：酚基,教案,咪唑基修饰,组氨酸含有咪唑基，咪唑基多为酶活性中心的必须基团修饰剂：碘乙酸、焦炭酸二乙酯,常见基团的化学修饰反应：咪唑基,教案,吲哚基,色氨酸含有吲哚基，色氨酸残基疏水性强，通常位于分子内部，难于修饰修饰剂：N溴代琥珀酰亚胺

5、2羟基5硝基苄溴4硝基苯硫氯,常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基,教案,分子内交联修饰,含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法,（三）酶的大分子修饰,采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团(共价)结合使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法,非共价修饰,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。如多元醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白质。,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋

6、糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,共价修饰,大分子修饰(共价)的过程,修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂

7、的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,应用最广的修饰剂,聚乙二醇是线性分子，溶解度高，具有良好的生物相容性，在体内无毒性、无残留、无抗原性，分子末端有可活化的羟基，活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。可用多种不同试剂活化，修饰不同基团聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺,将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法称为氨基酸置换修饰,(四)氨基酸置换修饰,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法例如，Bender

8、等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。,1.化学修饰方法氨基酸置换,2.定点突变法氨基酸置换,现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变（site directed mutagenesis）是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位

9、置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。,定点突变过程,1、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其存在的问题）2、突变基因序列的确定（考虑物种差异）3、突变基因的获得（DNA合成仪PCR）4、新酶的获得（重组、转入宿主、表达）,（五）金属离子置换修饰,1、概念2、作用范围3、常用金属离子4、方法步骤,1、概念,通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。,2、作用范围,含有金属离子的酶金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。（

10、2）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。,3、常用金属离子,（往往是二价离子）:Ca 2+，Mg 2+，Mn 2+，Zn 2+，Co 2+，Cu 2+，Fe 2+等。,4、金属离子置换修饰的过程,a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离

11、子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,（六）亲和修饰,亲和标记是一种特殊的化学修饰方法，它利用酶与底物的亲和能力，使用与底物或配体结构类似的修饰剂，对酶活性中心上的氨基酸残基进行共价修饰修饰。,二、酶修饰后的性质变化,热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。半衰期：一般在体内

12、的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶经修饰后，Km值变大。,回本章目录,侧链基团修饰的主要作用,1.研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。2.测定某一种基团在酶分子中的数量3.提高酶活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性、引起酶的催化特性和催化功能的改变4.获得自然界原来不存在的新酶种5.用于酶蛋白分子

13、的固定化,大分子结合修饰的效果,提高酶活力结合后酶空间构象的改变使活性中心更有利于和底物结合，形成催化部位例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍,增强酶的稳定性空间结构更为稳定，活性中心得到保护,降低或消除酶的抗原性分子结构的改变使抗体不能识别提高抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。,三、化学修饰方法的几个问题,决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性，尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回收。为此，有时需要通过反复试验来确定。

14、其中：对酶性质的了解：活性部位、稳定条件、反应最佳条件及侧链基团性质等；选择修饰剂考虑：1）分子量、修饰剂链长和对蛋白吸附性；2）修饰剂上反应基团的数目及位置；3）修饰剂上反应基团的活化方法和条件（一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团）；选择酶反应条件要注意：1）反应体系的溶剂性质、盐浓度、PH、温度、时间；2）酶与修饰剂的比例。参考：酶工程 P.86,(一)、试剂的选择要根据修饰目的选择,例如对氨基修饰可有几种情况 修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰-氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；,用于修饰酶活性部位氨基酸残基的试剂应具备：,

15、选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性条件下进行；修饰反应的程度能简单测定；,(二)、反应条件的选择,不造成蛋白质的不可逆变性（通过对照实验）；有利于专一性修饰（小心控制条件，尽可能在酶蛋白特定构象不变或少变的情况下进行）；温度、pH、反应介质和缓冲液；,在所有影响化学修饰的反应条件中,pH值是最重要的一个条件,因为它决定了具有潜在反应能力的功能基团所处的可反应和不可反应的解离状态。一般情况下,增加pH可以提高反应速率,降低pH可以减小反应速率。反应活性较高的修饰剂可以在生理pH下与蛋白质耦合;而反应活性较低的修饰剂通常需要较高的pH。修饰反应的专一性则对应有一个优化pH值。,(三)

16、、反应的专一性,除考虑修饰试剂专一性、控制反应条件外，还可利用其它途径来实现修饰专一性：亲和标记试剂（如甲基苯磺酰氟作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上）差示标记（在底物或抑制剂存在下进行化学修饰利用蛋白质状态的差异（如在结晶状态下反应）,四、酶化学修饰的应用,在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适pH等酶学性质。在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数

17、量。,五、酶蛋白化学修饰的局限性,1.某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂。2.化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释。3.酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，目前还不能用化学修饰的方法研究非极性氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用。4.酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸残基被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性所“必需”的，为什么是必需的，还得用X射线和其他方法来确定。因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性。,第二节 酶分

18、子的物理修饰,通过物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。,变性、诱导与构象重建（对酶高级结构调整）,酶肽链变性松散后，使其在有底物类似物或抑制剂存在的非天然条件下复性，酶将折叠成所需要的特殊结构，产生新的性状，此即变性诱导构象重建的原理。,实验证据：在8mol/L尿素存在下，用巯基乙醇处理天然Rnase（核

19、糖核酸酶）,其二硫键全部断裂，肽链松散，活性全部丧失，但当用透析法除去尿素、巯基乙醇后，RNase活力全部恢复，而且复原后产物其物化性质与天然RNase完全相同。,第三节 蛋白质工程和酶的定向进化（基因水平上进行蛋白质改造）,一、酶蛋白质工程,酶作为生物催化剂的应用和发展,主要取决于其成本和功能。从天然产物中直接分离获取有应用价值的酶,其来源就局限于为数不多的低成本天然产物。性能更好的酶,如果是来源于生产性能差的微生物则难以利用,更谈不上其他高等生物的酶的利用。,教案引言,基因重组技术的应用是酶技术的又一革命性突破。通过转基因技术,目的蛋白的基因拷贝可以数十倍地增加,几乎可以达到微生物体系生产

20、蛋白的极限,使得酶的生产成本又一次飞跃性地下降。更重要的是,转基因技术在理论上使得几乎所有来源的酶的生产成为了可能,而在实践上也实现了相当多数来源的酶的人工生产。酶的选择不再决定于其来源,而在于其性能。,教案引言,蛋白质工程以重组DNA技术为基础，结合X-衍射分析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技术体系，也是在基因水平进行蛋白质改造的技术科学。,一、酶蛋白质工程,（一）概述,1、蛋白质工程的主要目标2、酶蛋白质工程所需基本信息 3、酶蛋白质工程的流程4、酶蛋白质工程的前景,教案引言,1、蛋白质工程的主要目标,(1)功能的改变(2)结构特性的改变(3)新体系的创

21、造,蛋白质工程的主要目标,(1)功能的改变 提高 Vm,减小 km，改变最适 pH,去除抑制部位,改变催化反应的特异性,去除影响稳定性的残基。(2)结构特性的改变 提高热稳定性,提高在有机溶剂中的稳定性,改变物理化学特性,改变配位体的结合特异性。(3)新体系的创造 杂化和多功能酶,添加便于分离的片断,改进治疗用酶的有效性。,教案引言,2、酶蛋白质工程所需基本信息,酶的基因克隆;该基因的序列;活性部位的作用机理,更理想的是涉及活性部位的氨基酸;酶的晶体结构,或者至少是同源性很高的蛋白质空间结构。,3、酶蛋白质工程的流程,相关的序列及 3D 结构数据库,4、酶蛋白质工程的前景,酶的蛋白质工程是典型

22、的多学科综合研究,所涉及的学科不仅有酶学、蛋白质化学和分 子生物学,而且还涉及蛋白质结构解析和生物信息学分析。在对于天然的蛋白分子的研究还未总结出可以基本涵盖绝大多数情况的结构与功能的规律之前,酶的蛋白质工程不可能成为主要的创造新酶源的手段。酶的蛋白质工程将创造出大量具有新的、功能更好的酶产品，蛋白质工程对于分子性能的改善程度和功能创新的多样性,将会超过现在最具想像力的预测。,（二）蛋白质结构分析与结构预测,蛋白质所具有的功能在很大程度上取决于其空间结构,因此对蛋白质空间结构的研究在蛋白质工程中有着极其重要的意义。蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息,以便建立结构与功能之

23、间关系的数据库,为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。,1、蛋白质结构测定,1）一级结构测定2）三维结构测定3）蛋白质结构分类,1）一级结构测定,蛋白质一级结构的测定是蛋白质立体结构测定的前提,其基本步骤是:应用化学裂解法或蛋白酶水解法将多肤链专一性裂解,得到一系列肽段;逐一测定每个纯化的小肽段的顺序;根据肽段氨基酸顺序中的重叠区确定小肽段的排列次序;完成整条多肽链的顺序分析。,2）三维结构测定,测定蛋白质三维结构的方法主要有两类:蛋白质晶体 X 线衍射法;多维磁共振法。,蛋白质晶体 X 线衍射法,X线衍射法是迄今为止研究蛋白质三维结构最有效的方法,所能达到的精度是任何其他方法所不能比

24、拟的。它的缺点是蛋白质的晶体较难培养、晶体结构测定的周期较长。,0.5nm 分辨率 0.3nm 分辨率 0.2nm 分辨率 0.15nm 分辨率,0.5nm 分辨率 0.3nm 分辨率 0.2nm 分辨率 0.15nm 分辨率,多维磁共振法,多维磁共振法近年来发展较快,可以直接测定蛋白质在溶液中的构象,但对样品的需要量大、纯度要求高,被测定的蛋白质的相对分子质量一般不超过 20000,因此其应用也受到很大限制。,3）蛋白质结构分类,大量蛋白质分子空间结构的测定使得有可能对蛋白质进行结构分类。目前一般将蛋白质按照空间结构分成如下几类：只含螺旋,如血红蛋白;只含折叠,如过 氧化物歧化酶;既有螺旋,

25、又有折叠,又可分为两类/类:螺旋和折叠交替出现,如黄素氧化还原蛋白;+类：一螺旋和折叠彼此不相关,如天花粉蛋白。其中,以第三类为最多。,2、蛋白质结构预测,蛋白质三维结构很大程度上决定了蛋白质的功能,因此如何获得蛋白质的结构并对其分析研究是现代分子生物学的重要课题。从遗传信息到最后的遗传物质的表达即具有活性的蛋白质,可以说包含两组密码,从 DNA 到蛋白质的一级结构,再从一级结构到空间结构。,1）预测二级结构的方法,预测二级结构的方法主要有以下几种:经验预测法 概率预测法 立体化学预测法由于目前对二级结构中氨基酸的中远程相互作用不完全清楚,因此预测准确率一般在 65%以下。,2）蛋白质三维结构

26、预测,蛋白质结构预测的最终目标主要有两个方向:根据二级结构、结构类型和折叠类型预测的结果,结合结构间的立体化学性质、亲疏水性质、氢键以及静电相互作用,把可信度较高的二级结构进一步组装,搭建出最后的蛋白质结构;不依赖二级结构预测的结果,直接预测三维结构。,(1)同源蛋白质结构预测,通过对类似蛋白质空间结构对比发现,蛋白质的三维结构比蛋白质的一级结构更加保守,氨基酸残基序列有 50%相同的蛋白质,约有 90%C 原子偏差不超过 3A,均方根偏差约 1A。若待测模型构建蛋白质的序列与模板序列经比对后的序列同源性在 40%(也有人认为在 35%）以上,则它们的结构可能属于同一家族,是同源蛋白,可以用同

27、源蛋白模型构建的方法预测其三 维结构。因为它们可能是由同二种蛋白质分化而来,具有相似的空间结构,相同或相近的功能。,教案引言,因此,若知道了同源蛋白家族中某些蛋白质的结构,就可以预测其他一些序列已知而结构未知的同源蛋白的结构,可以用同源模型构建的方法预测未知蛋白质的三维结构。它的基本原理是根据同源结构中的保守部分搭建出未知蛋白质的结构骨架。这是目前最成熟的预测方法,并已有商业化软件可以使用。自从 Blurldell 等人于 20 世纪 80 年代末提出同源蛋白质结构预测以来,已有许多此类结构预测的报道。,教案引言,(2)反向折叠法,蛋白质反向折叠又称蛋白质逆折叠。反向折叠法的主要原理是把未知蛋

28、白质的序列和已知的结构进行匹配，找出一种或几种匹配最好的结构作为未知蛋白质的预测结构。然后经过对现有的数据库的学习总结，得出可以区分正误结构的平均势函数，以此来选择最佳的匹配方式。,二、定向进化,定向进化属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。试管中的进化是生物工程的未来 诺贝尔奖金获得者 M.Eigen,1、定向进化的原理,在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3-5校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向

29、目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+定向选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。,3、定向进化不是定点突变,定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是

30、已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。,教案,4、定向进化与自然进化的异同,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：,进化动力不同：进化方向不同：进化速度不同：进化目标不同：,教案,5、酶体外定向进化的意义,理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药

31、等领域逐渐显示其生命力。,（二）随机突变的策略,易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling)随机引发重组交错延伸技术,教案,PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1985年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,1.聚合酶链式反应（PCR）,教案,PCR技术的原理,多聚酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程，在待扩增DNA片段的两侧与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸

32、若干个循环后，DNA扩增2n倍。,教案,聚合酶链反应（PCR）仪,教案,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合,变性,引物,退火,教案,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,延伸,第二轮扩增,循环,延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,教案,聚合酶链反应,(d)更多轮反应,扩增的片段呈指数增长30个循环后产生228=268 435 456个片段,(e)产物的可视化,PCR产物,DNA大小标准物,琼脂糖凝胶,教案,PCR实验的基本步骤：(1)94模板D

33、NA变性(2)5060寡核苷酸引物的退火(3)72(或74)新的DNA合成(4)重复循环30-35次,PCR（Polymerase Chain Reaction）技术 就是在体外快速扩增特定基因或DNA序列的一种方法。,教案,设 定 正 确 的 温 度,变 性(1min),退 火(1min),延 伸(2min),教案,温度对引物和模板的杂交有重要影响,(a)退火温度太高,(a)退火温度太高,(b)退火温度太低,引物与模板仍相互分离,错误杂交 不是所有引物与模板形成正确,教案,(c)合适的退火温度,温度对引物和模板的杂交有重要影响,引物仅与模板上期望的目的位点相接合,教案,用设计的质量不同的引物

34、扩增出来的PCR产物,Lane 1:good Lane 2:nothingLane 3:wrong size Lane 4:mixture,教案,2、易错PCR,易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。连续易错PCR(sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。,教案,3、DNA改组,DNA改组（DNA shuffling）有译为DNA“洗牌”又称有性PCR(sexual PCR)。首先利用DNA 聚合酶的错配进行错误导向PC

35、R 产生随机突变子库,用Nase或各种限制性内切酶消化父本基因,产生适当大小的片段,这些片段再经重新装配、扩增形成的突变文库具有更大的多样性。(这一步可以反复进行多次),再扩增和克隆带有多点突变的基因,最后筛选期望的重组子。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。,教案,DNA shuffling,采用DNA shuffling 枯草杆菌蛋白酶的抗热性提高了17,65 的耐热时间提高了200多倍。,教案,4、外显子改组,外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，外显子改组尤其适用于

36、真核生物。不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。,教案,5、体外随机引发重组,体外随机引发重组(random priming in vitro recombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。,教案,6、交错延伸,交错延伸(stagger extension process,StEP)在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链

37、，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。,教案,7、随机片段交换,该方法主要由三个步骤组成,即基因破碎;添加随机短序列;重新组装。首先常规PCR 扩增待突变基因。接着用DNase消化,获得一系列大小在100300bp 之间的DNA 碎片。然后在末端脱氧转移酶(TdT)的作用下,DNA 碎片的3 末端被随意加上一个至几个碱基。随后这些带3 尾巴的短片段互为引物进行PCR 重新组装。最后加入两端引物扩增出全长基因。,教案,（三）突变库的高通量筛选,创建基因突变库的方法目前已有很多,但是建立起来的突变库的容积普遍比我们有能力筛选的蛋

38、白数量要高出几个数量级。此外,创建基因突变库的方法比较通用,但是对于酶活性筛选却必须针对不同的酶和反应制定不同的筛选方法。定向进化的最大瓶颈是缺乏通用的高通量的筛选方法,或比较通用的针对目标活性的选择方法。所以高通量筛选日益受到人们的重视。,教案,1、定向进化的选择策略,（1）定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。（2）通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等

39、。,教案,目前,传统的有效筛选方法大多是采用琼脂平板克隆筛选或利用荧光检测粗酶裂解液的酶活。它的局限性在于灵敏度低。只有十分活跃的突变体才能被检测出来。如果不使用自动化的仪器辅助,很难达到高通量的目的。筛选的目标是找到一种有效的筛选方法能够将稀少的有益突变体从巨大的突变库中挑选出来。对于高通量筛选而言,最主要的困难在于如何将基因、基因编码的酶及反应的产物有机地联系起来。,教案,2、细胞或噬菌体展示,将底物连接到表达目的酶的噬菌体上,有活性的突变体转化噬菌体连接的底物成为产物,而产物依然连接在噬菌体表面。再通过能够特异吸附产物的层析柱时,带有活性酶的噬菌体被分离出来。,教案,3、核糖体展示,通过

40、PCR 扩增建立突变的DNA 文库。置于具有藕联转录/翻译的无细胞翻译系统中孵育。使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面,并形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体。最后利用常规的免疫学检测技术,通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体。再利用RT-PCR 扩增,进行下一循环的富集和选择,最终筛选出高亲和力的目标分子。,教案,4、基因作用机制筛选,基因作用机制筛选或体内筛选是定向进化的传统工具。这种选择方案是基于进化产生的活性与缺陷型宿主互补。利用酵母三杂交系统,将酶的催化活性与报告基因的转录联系起来。从进化目标的广泛程度来讲,这种方法的应用是有限的。,教案,例如：筛选蛋

41、白酶突变体利用分泌蛋白必须经过高尔基体的特性,将转化酶INV 与高尔基体膜附着蛋白STE13 通过连接蛋白链相连。将突变基因转入酵母体内,如果表达的蛋白酶突变体能特异性识别该序列,INV 就会被从高尔基体膜上切除下来,分泌到胞外,转化利用蔗糖,酵母细胞生长。如果蛋白酶突变体不能识别并切断该序列,则该酵母细胞在蔗糖培养基上不能生长。,教案,5、体外区室化,体外区室化是将水相混入油相体系中,形成较小的水相区室,建立一个水/油体系。平均每个液滴包含单个基因,液滴的体积容许单个DNA 分子进行转录、翻译及酶分子的检测。周围的油相惰性较大,限制了基因和蛋白在不同区室间的扩散。体外区室化提供了一个简便的方法,使基因和其编码的蛋白共同区室化于一个空间中,但是酶活的选择需要将基因与反应的产物联系起来。一个可行的选择方案是将酶催化的底物与起始基因合二为一,进而再来分析产物的有无,这样编码酶的基因就可以通过对产物的捕捉而被挑选出来。这个策略最经典的应用是针对DNA 修饰酶类的筛选。,教案,（四）定向进化的应用,教案,