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1、PCR技术,课程安排,PCR扩增：人HLA-DRB基因（基因组DNA为模板）人-actin基因（cDNA为模板）PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（-actin）PCR产物的SSCPPAGE分析（HLA-DRB）,PCR基本原理及相关知识,概念 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。,Kary Mullis,PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的。Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝
2、尔化学奖。,相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。,PCR扩增DNA片段的原理,PCR是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：,变性：加热，模板DNA形成两条单链 退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合 延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3-端向前延伸，合成与模板配对的新链,上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DN
3、A就可以扩增106109 倍。通过循环可以提高PCR的特异性。,PCR反应体系的组成及功能,一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，PCR引物设计的原则：17；目的是提高扩增的效率与特异性。终浓度为0.10.5umol/L,引物设计的一般步骤及其原则 获取目的基因序列，或者 采用引物设计软件如Primer premier 5.0、Oligo 6.0获取适合于该目的基因的所有可能的引物集。按照下列原则挑选出你认为最合适的引物。一般评分大于80 扩增产物长度 以200-500bp为宜，G+C的含量在4060%之间，正向引物、反向
4、引物以及内参引物的G+C含量和 Tm值应接近,引物长度一般1827bpATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。3端第一个碱基尽量不要是A，也不要出现3个以上的连续碱基序列，如GGG等，3端与模板严格配对。尽量减少发夹结构和引物二聚体的形成，特别是在引物的3端 Primer 5未端可修饰、突和增加额外碱基（限制性核酸内切酶识别位点），但绝不可以在3端进行这些改造。RT-PCR两引物间序列要跨一个内含子设计好后对引物进行数据库blast，应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,Taq DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活性，
5、它不具有Klenow酶的35校对活性.因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的.Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4.其活性对Mg2+浓度非常敏感 终浓度一般为：2.5u/100ul,模板DNA 相对于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102104拷贝模板就可以满足要求。dNTP(dATP dCTP dGTP dTTP)已有商品化的混合液，终浓度一般为20 200umol/L。,10PCR反应buffer：已作成商品化的产品，它包括：250500mmol/L KCl；100500mmol/LTri
6、s-HCl（pH8.4）；1520mmol/L MgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5 2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）；0.1%明胶或牛血清白蛋白,dd H2O 调节反应体积 液体石蜡油（PCR仪有热盖则不用加）,影响PCR的主要因素 PCR反应体系的各个组分 PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）PCR循环的次数和平台效应 操作环境,平台效应及其原因,实验一 PCR,常用的PCR反应体系：10PCR Buffer 5ul上下游引物（25M）2uldNTPs（2.5mM）4ulTaq DNA聚合酶 0.5ul（2U）模板DNA 0.1至1ug
7、ddH2O 补足体积至50ul,实验试剂：2PCR Mix:Taq酶，四种dNTP，PCR反应buffer引物：上下游特异性引物水（dd H2O）：用以补足体积基因组DNAcDNA,实验操作及注意事项,建立PCR反应体系1.扩增-actin基因-actin引物 2 l cDNA 4 l 2PCR Mix 15 l 水 9 l total volume 30 l,2.扩增 HLA-DRB 基因 HLA-DRB引物 2 l 基因组DNA 4 l 2PCR Mix 15 l 水 9 l total volume 30 l,此步注意事项：1.每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染 2.避免重复加样或
8、漏加样。3.加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。4.加完试剂后离心将液体汇集管底。5.对没有热盖的PCR仪要加封石蜡油。,扩增-actin基因程序的建立 预变性 945min 变性 9445s 复性 5945s 延伸 721min 续延伸 7210min 保存 4,30 cycles,扩增 HLA-DRB 基因程序的建立 预变性 945min 变性 9445s 复性 5545s 延伸 721min 续延伸 7210min 保存 4,35 cycles,实验二DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA,常用DNA分析技术,定性分析：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电 泳、southern-blottin
9、g、芯片技术等定量分析：分光光度法、荧光分光光度法序列分析：末端终止法、化学裂解法,一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳 电泳及其基本原理 常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）,利用物质的两个差异来分离物质,电荷差异 电荷性质 电荷数量,分子差异 分子大小 分子形状,二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳电泳及其基本原理 常用的电泳方法 琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）,三、DNA琼脂糖凝胶电泳原理,在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网
10、络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的。,四、DNA琼脂糖凝胶电泳实验操作 实验目的及意义 1.-actin基因扩增产物的鉴定 2.掌握DNA琼脂糖凝胶电泳实验方法,实验材料及试剂 材料：-actin基因扩增产物 试剂：1%琼脂糖凝胶（配制方法）电泳缓冲液：1 TAE（10 上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、甘油）溴化乙锭（其它荧光染料如花青类染料 SYBR Green I 及GoldView等）,琼脂糖凝胶板的制备（凝固后拔梳）,琼脂糖凝胶板的放置（加样孔在负极）,-actin 扩增产物10ul2ul上样缓冲液(每块胶留一孔加Maker10ul)，电泳（100V,约1h）
11、紫外检测,实验操作及注意事项,50bp,100bp,200bp,300bp,400bp,实验三PCR产物SSCPPAGE分析,SSCP-PAGE原理 单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而在电场中迁移率不同，在聚丙烯酰胺凝胶中分子筛效应不同。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，为DNA单链构象多态性(Single-Strand Conformation polymorphism，SSCP)分析.SSCP-PAGE检查PCR扩增产物的基因突变十分广泛。,SSCP-PAGE特点
12、 1DNA长度为150-300bp(本实验中HLA-DRB扩增片断为227bp)突变体检出效率最高。2理论上讲SSCP能够100%的检测出突变体。(7080%)3.要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序,PCR-SSCP基本过程 1PCR扩增靶DNA。2PCR产物的快速变性而后快速复性，形成特定 空间结构的DNA单链分子。3.非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4.PAGE胶的银染,PCR-SSCP结果判定 单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，存在碱基突变.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难 看出两者之间的差别,因此一般要求电泳长度在16-18cm
13、以上.以检测限为指标来判,检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值,一般检测限定为3mm。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化。,SSCP-PAGE应用 在遗传学方面的有广泛的应用，例如，癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查，遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断，法医的亲子鉴定和个体识别。,人类白细胞抗原系统(HLA)，存在多态性：器官移植配型 疾病发生有关 个体鉴定 亲子鉴定,PCR-SSCP检测HLA-DRB用于亲子鉴定(通用引物扩增HLA-DRB及其7个假性基因),实验材料及试剂 材料：人HLA-DR的PCR产物 试剂及其功能：丙烯酰胺混合液：3
14、0%(Acr:Bis,29:1)10%AP(新鲜配制)TEMED(四甲基乙二胺)5TBE缓冲液 变性上样液：95%甲酰胺，指示剂，EDTA,玻璃板的组装和封边，电泳槽及电泳玻璃板的固定（已准备）8%非变性PAGE胶的制胶：30%丙烯酰胺混合液 8ml dH2O 15.7ml 5TBE 6ml 10%AP 280 l TEMED 20 l 用吸管迅速将配好的PAGE胶灌满电泳玻璃板的空隙,实验操作及注意事项,立即插入点样梳（不要带进气泡），等待胶聚合（约30min1h）多余的胶留置烧杯，观察聚合情况，用以判断玻璃板中是否聚合待胶凝聚后，小心拔梳，用电泳缓冲液冲洗上样孔,取10ul HLA-DRB
15、扩增产物与10ul 甲酰胺变性液在0.2ml Ep管中混匀。上样前98加热10min，后立即冰浴骤冷取10 l变性处理样品上样（速度要快），100V电泳34 h 银染,实验四聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染,原理 在弱酸环境下银离子可以与DNA结合，碱性甲醛溶液可以将结合的银离子还原成金属银，显影成DNA区带。,实验材料及试剂 材料：DNA非变性PAGE胶 试剂及其功能：10%乙醇 1%硝酸 0.2%硝酸银 显色液（3%Na2CO3，1%甲醛，新鲜配制）3%乙酸,电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘（不要碰凝胶表面！）用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板去水后，用10%乙醇进行凝胶固定
16、10 min，轻摇去乙醇，水洗、加入1%硝酸，轻摇5min吸出硝酸，用蒸馏水漂洗2次,实验操作及注意事项（下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜）,加入0.2%硝酸银溶液，轻摇20min蒸馏水漂洗3次去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色观察区带出现，效果最佳时移除显色液加入3%乙酸，轻摇5min移除3%的乙酸溶液，10%乙醇洗涤1次观察结果,结果分析与问题讨论,SSCP-PAGE影响因素 1用于分析的核酸片段越小，敏感性越高，一 般 150-300bp 2游离的引物可与PCR产物结合影响其泳动 3.保持胶内温度恒定可保证SSCP结果的稳定 4.凝胶的长度:一般凝胶板长度在40cm以上,6.关于对照的设置。判断突变时一定要有阳性对照。假 阴性结果是SSCP的主要缺点 7.结果分析：结果至少显示3条带，甚至可以出现更多条 带（一种DNA单链有时可形成两种或多种构象）。,Thank you！,
