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1、实验三：DNA提取及PCR反应,蒋建伟,第一部分：DNA提取,一、DNA提取的基本步骤,三、DNA提取常见问题与对策,二、DNA提取注意事项,一、DNA提取的基本步骤,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,DNA提取,（一）样品准备：1、组织：3 g 组织，用8 层纱布包好，再包多层牛皮纸，浸入液氮，取出，用木锤敲碎。碎组织放入搪瓷钵中，加少量液氮，碾磨至粉末状。在50 ml离心管中，加10 ml DNA提取液，用玻棒边搅动液体，边加入组织粉末，37 混匀。2、组织，3 g，-70 保存，临用时用玻璃匀
2、浆器，用DNA提取液 将组织磨成匀浆。注：DNA提取液 见 p-8 或 p-11,下同。,（一）样品准备,3、培养细胞 消化收集细胞，PBS洗3次，加10ml DNA提取液，混匀。4、血液取血液离心，取淡黄色白细胞层，加NS，离心。或者加D2.H2O，离心，收集白细胞。加10 ml DNA提取液，37 mix。,（一）样品准备,（二）提DNA,酚抽提法：加RNase，371 h，加蛋白酶K，50，3 h；或 37 12 h,不时mix加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。氯仿-异戊醇(24
3、:1)抽提1次。9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。移到50ml烧杯中，加2.5倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。TE 溶解。,2、异丙醇沉淀法：原理：用2倍体积异丙醇沉淀DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA溶于异丙醇中，可除去RNA。细胞，PBS洗2次。3 ml TEN重悬，加DNA提取液，蛋白酶K，5014 h加等体积饱和酚，混匀，9000rpm 3 min，小心吸取上层粘稠水相。氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次，9000rpm 3 min，小心吸取上层粘稠水相。加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。TE溶解。,（二）提DNA,SDS法-提取DNA,SDS是一种阴离子去垢剂
4、，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,小 结,SDS法流程图（以动物组织为例）,基因组DNASDS法,CTAB法,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂
5、质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,举 例,CTAB提取缓冲液 的经典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一
6、种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,CTAB法流程图：,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,二、DNA提取注意事项,1.材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,注意事项,2.细胞裂解,适量。过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理 方式：植物材料液
7、氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,注意事项,3.核酸分离、纯化：,采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。,基因组DNA的提取,注意事项,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理,多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用 多糖水解酶 将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2,v/v)，氯
8、苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,注意事项,多酚的去除：在抽提液中加入 防止酚类氧化 的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,盐离子的去除：70的乙醇洗涤,注意事项,4.核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的 乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀。沉淀后应用70的乙醇洗涤
9、，以除去盐离子等。晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase。pH值为8.0，可防止DNA发生酸解。,基因组DNA的提取,注意事项,三、DNA提取常见问题与对策,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对策,DNA提取常见问题与对策,材料不新鲜或反复冻融未
10、很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。,问题二：DNA降解。,对策,原因,DNA提取常见问题与对策,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料。动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对
11、于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。低温沉淀，延长沉淀时间。加辅助物，促进沉淀。洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。,DNA提取常见问题与对策,问题三：DNA提取量少。,对策,原因,第二节 PCR反应 一、PCR反应原理和反应过程 二、PCR标准反应体系：三、PCR的反应条件（反应参数）四、PCR常见问题与对策 五、PCR衍生技术（略）,多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B.Mullis,PCR是由美国科学家Mullis提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,一、PCR反应原
12、理和反应过程,DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94 C 95 C 退火（annealing）:40 C 70 C 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。,Mullis的PCR构思,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,耐热DNA聚合酶,Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。,PCR反应循环,72,94
13、,55,PCR循环,变性,退火,延伸,二、PCR标准反应体系：,DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶,1 模板,单、双链DNA均可。注意模板的完整性，模板降解会导致PCR扩增无产物。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应。RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,2、引 物（Primers),引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。是化学合成的寡核苷酸，能与模板特异地结合，引物决定PCR产物的特异性
14、和长度。,引物设计的原则（一）,引物长度：15-30bp，常用为20mer左右.引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。Tm在55-65 最好。G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 5之内。,引物设计的原则（二）,避
15、免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带。引物 3端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点引物3端为关键碱基；5端无严格限制，引物的5端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）。,引物设计的原则（三）,引物的特异性：序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。引物量：引物浓度：0.1 0.2umol/L，浓度过高容易生成引物二聚体，过低则扩增产物减少。其他：避免反复冻融。RT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子。,3、脱氧核苷三磷酸
16、（dNTP）,是dATP、dCTP、dGTP和dTTP 4种脱氧核苷三磷酸的混合物。dNTP呈颗粒状，酸性，使用时应配成高浓度后，以1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为20200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度升高增加非特异性扩增；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,4、DNA聚合酶,从一种生活在热泉（8090）中的水栖噬热菌（Thermus
17、 aquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。Taq 酶的作用：在模板指导下，以dNTP为原料，在引物3-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3,5-磷酸二酯键，使DNA链沿53方向延伸，催化DNA合成。最适酶量：0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反应产量。,Taq DNA聚合酶复制的保真性：Taq DNA聚合酶无3 5外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。Pfu DNA polymerase具有较高的热稳
18、定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 10倍。,5、镁离子浓度,镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2 的浓度为1.5mmol/L较宜。,6、其它反应因素,pH：调节至酶反应所需的最适pH（pH=7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交,小结：反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物浓度 加量过多导致非特异性扩增增加特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体完整性 避免反复冻融浓度 应适当
19、,过高导致非特异性增加,过低则,引 物,扩增产物太少,小结：反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂,Mg 2浓度,过高非特异性严重过低无扩增产物,dNTP Mixture,浓度适当避免反复冻融,ddH2O,pH值适当避免污染,三、PCR的反应条件,（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）反应时间循环次数（PCR效率及产物量）,温度的设置：,设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，变性温度：94 97 退火温度：低于引物Tm 5 左右 温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶。对
20、于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般9394,1min足以使模板DNA变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于
21、引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。,引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm值（解链温度）=4（G+C）2（A+T）复性温度=Tm值-（510）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度 可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合,延伸温度与时间：,Taq DNA聚合酶的生物学活性：高于90时，DNA合成几乎不能进行 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子,
22、延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1 Kb以内的DNA片段，延伸时间1 min（足够）。34 kb的靶序列需34 min扩增10 Kb需延伸至15 min。延伸进间过长会导致非特异性扩增。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,3、循环次数,重复次数一般设为2535个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25或25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。,指数增长期平台期,循环数#,PCR过程的实时监测
23、,平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等,使用PCR增强剂,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂，其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。,增强剂浓度要适当,四、PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA
24、或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题之二,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,原因,对策,重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈S
25、mear状态。,M 1 2,PCR常见问题之三,模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,原因,对策,纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,五、以PCR为基础的相关技术,逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)定量PCR(quantitative PCR)多重PCR(multiplex PCR)免疫PCR差异显示PCR(differential display PCR,DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR(in situ PCR),
