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1、,DNA和RNA提取方法及原理,第二部分：DNA提取常见问题分析及对策,DNA提取专题,第一部分：DNA提取方法简介,前言,DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。,DNA提取原则,保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,DNA提取的几种方法,染色体DNA的提取,CTAB法SDS法其它,DNA提取的几种方法,非染色体DNA的提取,质粒DNA的提取,碱裂解法 煮沸法,线粒体、
2、叶绿体DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓
3、冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNA CTAB法,SD
4、S法原理,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法流程图（以动物组织为例）,基因组DNASDS法,基因组DNA其它方法,物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料阴离子交换树脂磁珠,高盐低pH
5、值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,基因组DNA其它方法,浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢
6、复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超
7、螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,第一部分：DNA提取方法简介,内容,第二部分：DNA提取及常见问题分析,DNA提取的基本步骤,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分
8、离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物
9、材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取
10、,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理,多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,核酸分离、纯化,多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇
11、)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：70的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,基因组DNA的检测,提取的基因组DNA片段在20kb30kb之间高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象D
12、NA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 g/mL 双链DNA；A260/280 约为1.8,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留,原因,对策,重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）加入RNase降解RNA,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,原因,对
13、策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DNA丢失,原因,对策,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。增加吸附的时间，或低温沉淀小心操作,RNA提取专题,
14、第二部分：RNA提取及常见问题分析,第一部分：RNA提取方法简介,分离提纯RNA的目的,分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物,RNA的不稳定性,由于核糖残基的2和3位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解 RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活,提取RNA的注意事项,经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染。使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase
15、。,常用RNA酶抑制剂,焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制
16、作用。,RNA提取专题,第二部分：RNA提取及常见问题分析,第一部分：RNA提取方法简介,RNA提取的步骤,材料的裂解,杂质的去除,RNA的吸附或沉淀,异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸 等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。,苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使DNA及蛋白沉淀到有机相。,硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经DEPC 处理的水溶解RNA,材料准备及裂解,尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小
17、块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存。液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。,RNA的提取,杂质的抽提,RNA的沉淀和溶解,含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀，70乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA样品收集后或需长期保存时应置于70 或加入RNase抑制剂，分装使用,RNA的提取,RNA的检测,电泳槽系统的处理乙二醛化琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳RNA纯度及浓度的检测（A260=1，约40 g/mL RNA；
18、A260/A280 约为1.9-2.1）,1 抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染2 DNA 的污染 3 离子浓度较高,原因,对策,1 保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化2 减少处理样品的量；加入不含RNase的DNase处理；再次纯化3 增加漂洗次数,RNA提取常见问题,问题一：RNA样品不纯,1 样品含有杂质杂液 2 样品过量或样品裂解 和匀浆不彻底3 RNA未有效的吸附沉淀或洗脱4 样品RNA含量少,原因,对策,1 去除样品中的杂质，离心除净样品中的培养基或储存液 2 减少样品用量；充分研磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间3 延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间；再次洗脱4 重复吸附，加入肝糖等有助RNA沉淀的试剂,RNA提取常见问题,问题二：RNA得率低,1 样品不新鲜或样品保存不当，RNA降解2 污染了RNase3 样品储存不当,原因,对策,1 尽量取新鲜的样品；取样后立即放入液氮保存；或放入专门的储存液内；研磨样品及时补充液氮2 认真地处理相应的器具和试剂；严格地操作3-70 冻存，分装使用；加入RNase抑制剂,RNA提取常见问题,问题三：RNA容易降解,
