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1、,第十一章 DNA文库的构建和目标基因的筛选,第一节 基因组DNA文库的构建第二节 cDNA基因文库的构建第三节 基因克隆的筛选策略第四节 DNA文库的保存,基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在)基因文库(gene library)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因组文库：材料来自染色体DNA，含有全部基因组序列。任何器官、组织、细胞、任何发育时期以及在任何环境下，基因组DNA是衡定的，所以用该生物的任何材料均可构建基因组DNA文库且具有一致性。,cDNA文库：材料来自mRNA，含有全部蛋
2、白编码基因的cDNA，无启动子、终止子、内含子、基因间隔区等，序列信息量远小于基因组文库。在高度分化的生物体中，不同器官、组织、细胞、不同发育时期以及对不同环境的应答中，mRNA种类和丰度不同，即表达谱不同，因此同种生物体的cDNA文库随表达谱变化而变化，用什么材料构建什么样的cDNA文库依研究目标而定。,第一节 基因组DNA文库的构建,一、基因组DNA文库的类型和发展1、质粒文库：容纳片段小于15kb，以菌落的形式保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：一般用载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建cDNA文库，置换型容纳9-25kb，适合于构建亚克隆文
3、库或直接构建基因组文库。3、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比文库略长，达45kb左右。4、人工染色体文库：有细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)、P1人工染色体(P1 artificial chromosome,PAC)等文库，最大插入片段分别为300kb、1000kb和300kb，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。,5、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、PFGC特定片段回收、特定YAC富集等方法而产生
4、，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。6、基因组文库的发展：略二、文库的代表性和随机性代表性意味着文库要有完备性，是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1 P)/ln(1 f)。其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。例：人的单倍体DNA总长为3.2 x 109 bp，假如文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆。随机性既表示构建文库时要从基因组DNA
5、获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。,基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。,1、基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后
6、样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。,如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段,三、基因组DNA文库的构建流程,超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。,2、基因组DNA的切割,用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：,第一，保证DNA片段之间存
7、在部分重叠区；第二，保证DNA片段大小均一。,连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以提高文库质量。,3、载体和受体的选择与制备出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或柯斯质粒；对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或插入型l载体。,几种载体的最大装载量：质粒 15 kb，-DNA 25 kb，考斯质粒 45 kb，BAC 300 kb，YAC 1000 kb。,用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌，根据载体不同
8、，需要对受体制备感受态或进行合适的培养。,载体制备中的注意事项：1）载体本身要完整2）载体去磷酸化要彻底3）载体纯度要高,4、连接重组、包装、转化/染连接：将制备好的基因组DNA片段与载体DNA混合，在T4 DNA连接酶酶的作用下进行连接，形成重组载体。基因DNA和载体DNA片段要足够纯，杂质少；连接时基因DNA片段与载体片段的摩尔比很重要，根据情况采用载体驱动或基因驱动策略；连接酶容易失活，操作条件很重要，16连接一至数小时。质粒载体等的连接产物可以直接转化宿主。包装：基因片段如果与载体重组，则重组需要包装进入特别制作的外壳蛋白中(包装蛋白要妥善保存)，然后用于感染大肠杆菌，产生噬菌斑。,5
9、、文库的质量检测克隆子数目要足够多，覆盖度要足够高(4-6倍或更高)；文库的滴度检测：1微克包装感染大肠杆菌后产生的噬菌斑的数量(pfu/g)，100万以上才合格。平均插入片段长度：小片段文库采用酶切法或PCR法结合电泳进行检测，大片段文库采用PFGE电泳进行检测。重组率：有目标片段插入的克隆子数占总克隆子数的百分比，许多文库的载体系统可以采用蓝白斑鉴定重组率。覆盖度：覆盖倍数=平均插入片段长度 克隆数/基因组DNA的长度。或：覆盖倍数=所有探针筛选到的阳性克隆子数/总探针数。叶绿体DNA的比例：小于5%。,第二节 cDNA基因文库的构建,一、cDNA文库的特征和发展：cDNA(complem
10、entary DNA):以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA，反义链)，以单链cDNA为模板还可以合成其反向互补链(取代mRNA的DNA链，正义链)，得到双链cDNA。将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性
11、。4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。,二、cDNA文库的构建：1、RNA的分离 mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1-5，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核
12、心。3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少，最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。4）RNA定量准确，保存合理。5）根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。,2、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT)，由反转录酶(reverse transcriptase,RTase)催化。反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶，合成DNA是需要引物引导。常用的引物有：oligo(dT)引物：在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物，oligo(dT)引物与mRNA 3末端的
13、poly(A)配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA，反转录的是整个表达谱，可以产生全长cDNA，应用最广。随机引物：与mRNA分子内的多处配对，从多个位置合成cDNA第一链，反转录的几乎是整个表达谱，最多只能产生近全长cDNA，适合于得到总cDNA的5末端。基因特异引物(gene-specific primer,GSP)：仅反转录特定目标基因cDNA的5末端。有AMV和MMLV两种RTase，最适温度分别为42和37，需要敲除其RNase H活性，较高温度反转录有利于打开mRNA的二级结构，得到全长cDNA。反转录过程中要防止mRNA降解，可以添加RNase抑制剂。,3、第二链
14、cDNA的合成cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。4种cDNA第二链合成的方法：自身引导合成法：解离的cDNA第一链的3末端会产生一个发夹状结构，可以引导第二链的合成，然后用S1核酸酶处理去除发夹结构。得到的5不完整，且S1核酸酶处理不好控制，易导致cDNA的丢失，所以该法现已少用。置换合成法：RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶、DNA连接酶联合处理，得到近全长cDNA，5缺失短序列。引导合成法：利用末端转移酶在cDNA第一链的3末端加上poly(dC)尾巴，利用poly(dG)为引物引导第二链合成，利用同源多聚尾与载体进行重组。引物-
15、衔接头合成法：引导合成法的改进型，在反转录引物和poly(dG)引物的5引入优化设计的人工接头，可用PCR扩增广大总cDNA，也为总cDNA与载体的连接提供了酶切位点。,4、双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖反转录和第二链合成过程中为cDNA两端引物合理的人工接头序列是关键（试剂盒），可以方便定向克隆和克隆子的处理。总cDNA的分级分离：采用排阻层析柱，去除过大和过小的cDNA分子，保留500bp至8kb的总cDNA，以提高连接后文库的质量。,三、cDNA文库的均一化处理1、基因组DNA饱和杂交法mRNA水平上，基因之间丰度差异极大。基因组水平，基因之间拷贝数差异不大。将随机打
16、断的基因组总DNA片段标记为探针，与总cDNA单链饱和杂交，弃除未杂交的总cDNA，从cDNA-DNA杂交体上变性释放除均一化后的总cDNA，转化宿主。优点是简单，缺点是易导致部分基因cDNA的丢失。2、基于复性动力学原理的均一化处理二次复性动力学原理(second-order kinetcs)：浓度大的组分复性所需时间短，浓度越小复性越迟。控制复性时间，用羟基磷灰石柱将单链和双链cDNA分开，保留单链cDNA后转化宿主。优点是基因丢失较少、均一化效果好，缺点是操作难度大。,四、扣除杂交cDNA文库利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的cDNA，保留差异表达的基因的cDNA用于制备文库。tes
17、ter:待测样本的总cDNA。driver:表达谱背景一致但不含目的基因的总cDNA。tester与过量的driver杂交，用特定方法将二者共同表达的cDNA去除。1、抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)为Clontech公司的专利试剂盒原理，将tester打上两组特定设计的接头，分别与过量driver进行第一轮杂交，然混合两种杂交体系进行第二轮杂交，通过PCR法特异扩增差异表达基因的cDNA，特定接头会通过锅柄结构而抑制非差异表达基因的PCR扩增。2、mRNA-cDNA杂交：过量的驱动总mRNA与总cDNA杂交，利用生物素磁珠法
18、将公共表达基因去除。,五、全长cDNA文库cDNA不完整的原因：mRNA的降解、第二链合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反转录酶的特性的RNase H活性、反转录酶与mRNA模板的脱离(主要受mRNA复杂结构影响)。1、SMART全长cDNA文库的构建方法为Clontech公司的专利试剂盒原理，应用广泛，其独特的反转录酶具有末端转移酶活性，RTase自动在反转录得到的全长cDNA第一链的3末端加上oligo(dC)，利用具oligo(dG)的接头引导第二链的合成。由于oligo(dC)比较短，因此较短的oligo(dG)容易介导合成假全长cDNA。,2、Cap-Trapper法构建全长cDNA
19、文库在mRNA的两端均打上生物素标记，合成cDNA第一链时用dm5 CTP代替dCTP，用RNase消化单链RNA。3、烟草酸性焦磷酸酶法构建全长cDNA文库Invitrogen公司的试剂盒原理，首先利用碱性磷酸酶处理使非全长mRNA无效化。用烟草酸性焦磷酸酶(tobacco acid pyrophosphatease,TAP)处理以移去全长mRNA的帽子结构，然后为脱帽后的全长mRNA的5末端接上人工接头，利用具oligo(dT)的人工接头进行反转录，得到的全长cDNA第一链的两端就打上了特别设计的人工接头，可用PCR法对全长总cDNA进行放大，酶切后与载体连接。优点是理论上全部cDNA都将
20、是全长，缺点是操作的技术性强。,六、其它cDNA文库表达cDNA文库：用表达载体构建全长cDNA文库，文库的每一个克隆子可以表达出蛋白，利用蛋白对克隆子进行筛选。双杂交全长cDNA文库：将表达文库与酵母双杂交系统结合使用，利用酵母作宿主，通过融合蛋白的酵母双杂交对克隆子进行筛选，用于鉴定可与特定蛋白相互作用的基因，主要为转录因子。重组酶克隆策略的cDNA文库：将重组酶的特异识别序列attP1和attP2构建到每个cDNA的两端，在非消化情况下实现与载体的重组连接，避免了基因被切断。,第三节 基因克隆的筛选策略,大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成，从其中筛选分离出某一个特定基因并
21、不是件简单的事。一、表型筛选法一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以赋予宿主特定的表型，可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法等）直接筛选，宿主多为突变体。该法传统多用于微生物基因的筛选。,二、杂交筛选和PCR筛选探针(probe)：用于通过分子杂交分离获得目标基因克隆子的核酸片段。探针来源：基因本身的部分序列、异源物种的同源基因序列、蛋白氨基酸序列反翻译推导的核苷酸序列、分子标记。筛选种类：菌落杂交筛选、噬菌斑筛选。一般要多轮筛选。PCR筛选法：将文库贮存于多个384孔板中，首先通过PCR确定目标基因所在的特定PCR板(主混合池筛选)，然后通过PCR确
22、定目标基因在特定PCR板上的特定行和列(行混合池筛选和列混合池筛选)，最后通过逐个克隆的PCR确定目标基因所对应的克隆子。,三、免疫筛选首先制备和纯化得到目标基因的抗体，然后利用抗体来筛选目标基因所在的表达文库，得到目标基因所对应的克隆子。方法有原位检测和免疫沉淀检测。四、酵母双杂交系统酵母双杂交(yeast two hybrid system)：研究蛋白与蛋白相互作用，主要为转录因子之间的互作。转录因子(如酵母的GAL4)一般具有两个结构域：DNA结合域(DNA binding domain,BD)和激活结构域(activation domain,AD)。已知蛋白X与BD融合(BD-X，诱饵
23、,bait)，未知蛋白Y与AD融合(AD-Y，猎物,prey)，当X与Y存在互作时，BD与AD接近并启动报告基因转录表达，否则不表达。,基因组文库重组克隆的排序,大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作。,将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。然后再用Sau3
24、AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱。电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的。,酶切片段末端标记法,H,H,H,H,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,S,单一克隆指纹图谱,十克隆指纹图谱,载体DNA,克隆DNA,将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的。用20种探针随机定位杂交（一对
25、一）20份YAC克隆薄膜。如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。,随机探针联合杂交法,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A B C,D E F,G,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,
26、1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,01,04,12,06,13,14,02,14,07,19,11,15,05,08,16,03,10,09,20,18,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,F,C,A,D,G,E,B,从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点,染色体走读法（chromosome walking）,走读的起点克隆片段,亚克隆旁测序列,探针标记,第一轮杂交,阳性克隆,阳性克隆,第二轮杂交,第二轮杂交,第四节 DNA文库的保存,文库的长期存在-80进行。噬菌体文库的保存：繁殖一次，分成若干小份，加2%至3%的氯仿可在4下保存数月，或加7%的DMSO长期保存于-80。落菌文库的保存：甘油贮存克隆子的菌液于-80。文库阵列法：保存大片段文库。,
