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1、DNA条形码技术在生物分类学中的应用,DNA Barcoding in the identification of medicinal plants,一、前言二、DNA条形码的概念及原理三、DNA条形码的标准及优点 四、DNA条形码的操作及分析方法五、DNA条形码在植物中的研究现状六、DNA条形码在药用植物鉴定中的应用,主要内容,一、前言,长期以来生物分类学家一直在寻找能够迅速区分不同物种的方法。自卡尔-林奈对生物物种进行系统分类以来，生物学家利用各种各样的性状颜色、外形和行为等形态或者解剖学特征的传统分类学来鉴定动物和植物，这些特征往往对形态近似种的鉴定较网难，且可能出现错误。最近数十年，研
2、究者开始利用DNA中携带的遗传信息来完成这个任务。DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种利用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定的新的分子生物学技术，是生物学近期研究的热点之一。,二、DNA条形码的概念及原理,DNA Barcoding的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。,DNA条形码的原理：DNA是生物的遗传信息载体，遗传物质的不同，决
3、定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，就给DNA条形码提供了物质基础。由于部分碱基的保守性，几十个碱基的长度不能提供足够的编码信息，因此目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。,DNA条形码技术（2003年,Herbert）是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。这个概念的原理与零售业中对商品进行辨认的商品条形码是一样的。简单地说，DNA条形码技术的关键就是对一个或一些相关基因进行大范围的扫描，进而来鉴定某个未知的物种或者发现新种。,自从提出DNA条形码的概念以来，这种新兴分类学技术已经引起了越来越多的生物学家的关注。DNA条形
4、码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术，它代表了生物分类学研究的一个新方向，因此它在生态、环境、食品等诸多领域都将会有广泛的应用。,DNA条形码技术的产生和发展Tautz等 首先提出运用DNA序列作为生物分类系统的主要平台，即DNA分类学(DNA taxonomv)的观点。2003年初，Hebert等首次提出用一种基因的序列作为鉴别不同物种的条形码，并选中C01基因。随后探讨该技术在鸟类分类鉴定中的可行性他们的工作推动了条形码技术在生物物种鉴定中的应用。2003年3月，20多位分类学家、分子生物学家和生物信息学家汇聚美国冷泉港召开了题为“Taxonomy and DNA”的会议提出对全球所有生物
5、物种的某个特定基因进行大规模测序以期实现物种鉴定的目标进而推进生物进化历史的研究。同年9月，在冷泉港再次召开题为“TaxonomvDNA and the barcode of life”的会议对DNA条形码鉴定所有真核生物的科学性、社会利益有了更深入的探讨。并且提出了组织策略及国际生物条形码计划(International bareode of life projeet)的发展蓝图。,2003年，加拿大圭尔夫大学(University of Guelph)Paul Hebert教授提出了“DNA条形码”概念。将条形码技术引入生物界。其思想产生于现代商品零售业的条形编码系统。将超市用以区分成千上
6、万种不同商品的条形码概念引入，利用A、T、C和G 4个碱基在基因中的排列顺序识别物种，他们把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNA barcodes），并提出为全球生物编码的计划。Paul Hebert教授率先于2003年选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit 1，c01)作为动物中通用的物种鉴定标记，并提出DNA条形码的定义：通过使用短的标准DNA片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定。Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdas
7、e I，CO I）基因序列比较分析,发现98%的物种遗传距离差异在种内为0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种。目前，DNA条形码技术在很多动物分类群中得到了成功应用,2004年秋，美国国立生物技术信息中心(NCBI)与生命条形码联盟(CBOL)签署合作。物种条形码的标准DNA序列及其相关数据将存档于GenBank。随后，GenBank提供的C01序列数迅速增长突出表现在除脊索动物之外各类群C01序列数量的剧增目前脊索动物的分类基本上都已经完成。2005年2月。伦敦举办了第一届全球DNA条形码会议对DNA条形码的分类理念、实验技术的细节分析以及资料库建立
8、等议题进行了讨论。最终目的是联合各个类群的DNA条形码数据库组建一个全球生物的DNA条形码数据库将此数据库设置在GenBank中让公众可以自由登录查询。,DNA条形码技术的原理DNA条形码技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术。DNA序列由A，T，C。G 4种碱基组成如果有n个碱基，就会有4n种编码方式。如果按照这个公式计算。15个碱基位点就能出现近10亿种的编码序列这个数字是现存物种的100倍。由于自然选择的原因。某些位点上的碱基是同定的从而导致可能的编码组合数减少。这可以通过只考虑蛋白编码基因来解决因为在蛋白编码基因里。由于密码子的简并性其第三位碱基通常都不
9、受自然选择作用的影响，是自由变化。一个长度300bp的蛋白质编码基因的核苷酸片段在第三密码子位点含有100个核苷酸这些位点上发生的替代通常都是中性选择并且大多数都是通过随机漂变在种群中固定下来的。在这100多个位点上就存在4 100种可能性为随后的序列比对分析提供了较大的可能性。随着分子生物学技术的飞速发展获得100多个碱基序列变得非常容易。,理想的DNA条形码应当符合下列标准 具有足够的变异性以区分不同的物种。同时应具有相对的保守性，以便于用通用引物进行扩增。必须是一段标准的DNA区来尽可能鉴别不同的分类群。目标DNA区应当包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统(科，属等)中的位置。目标
10、DNA区应该足够的短，以便有部分降解的DNA扩增。,三、DNA条形码的标准及优点,三、DNA条形码的标准及优点,Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA条形码标准：(1)可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小；(2)有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；(3)片段足够短，以便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解的DNA的扩增。,2004年，由Alfred Sloan 基金会赞助，在美国华盛顿特区举办了一个关于DNA 条形码的大型研讨会，此次会议创立了生命条形码联盟(CBOL,the Consortium for the Barcode
11、of Life)。生命条形码联盟阐述了DNA条形码的优点：(1)以DNA序列为检测对象，生物的DNA是由遗传信息决定的，因此同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。(2)可进行非专家物种鉴定。只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。,(3)准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差。(4)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，
12、从而推动分类学科更加快速深入地发展。,四、DNA条形码的操作及分析方法,DNA条形码的操作过程与分子生物学实验类似，包括采集材料并提取DNA、利用通用引物PCR扩增目的片段、纯化PCR产物、序序列测定与分析以及提交结果到相关数据库。条形码的应用目标是所有物种，并且每个物种需要多份材料。采集材料时应以传统的形态分类学知识为依据，尽可能地涵盖传统分类学中的变异式样。通常认为每个物种至少需要10份材料，并最好包括5个不同居群。,DNA的提取 根据样品的不同，可以采用不同的提取方法，例如CTAB法、Trizol QiagenDNeasykit等(DoyleJJ，DoyleJL.1987)设计通用引物
13、一般情况下，可以通过分析NCBI和GenBank数据库中的DNA序列，在模板的保守区内利用专业软件设计引物。,PCR扩增以样品DNA为模板，利用通用引物进行扩增。不同序列有不同的PCR程序。有时需要在实验中调整PCR程序，才能得到目标序列。一般而言，如果样品DNA纯度高且完整，则有利于PCR的进行。如果样品DNA有较为严重的降解现象，可以根据基因叶绿体trnL(UAA)内含子的短片段重新设计通用引物，有利于序列扩增。,全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通梯度PCR仪,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,
14、基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,琼脂糖凝胶电泳 用于检测PCR扩增效率，选取扩增效果好的样品，进行单向或双向测序。测序原理 目前用于测序的技术主要是Sanger于1977年发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法。,这种测序方法是根据核普酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核普酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。基本原理是每个反应含有所有四种脱氧核营酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同双脱氧核普三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddN
15、TP缺乏延伸所需要的3一OH基团，使延长的寡聚核普酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。,序列分析生物条形码工程的首要目标是建立可用来作为鉴定标本工具的基因序列数据库。目前只建立了动物条形码数据库，植物条形码尚处于评估阶段，只有该技术在植物中进一步完善后才有可能建立相应的数据库。序列数据分析是DNA条形码探索的最重要环节，由于植物的种间杂交现象比较普遍，因此植物条形码的分析方法也处于不断的摸索中。,目前报道的序列分析方法基本分为以下几步：(1)序列比对和人工校正。一般采用Clustal W，生命条形码数据库中使用Hidden Markov Models行序列比对，也
16、可以BLAST search在Genbank中搜索相似的基因片段对比片段信息的可靠性。(2)遗传分析。植物条形码需要对不同片段的种间和种内变异进行对比，以选择最佳的片段或片段组合。种间距离基本采用Kimura-2-parameter distance(K2P)模型计算。理想的DNA条形码检测到的种间遗传变异应明显大于种内遗传变异。(3)系统学分析。采用标准的系统学分析方法，建立系统发生树，检验同一个物种的不同个体能否聚在一起。,五、DNA条形码在植物中的研究现状,在植物中DNA条形码的研究进展相对缓慢，主要有两方面原因：(1)植物线粒体基因组进化速率较慢，遗传分化小，因此动物中的标准片段COI
17、不适用于植物；(2)系统学研究中常用的片段变异较小，不适合用作条形码片段(Chase et al.,2005;Kress etal.,2005)。由于核基因组通常具有多拷贝的特性，且物种内变异较大，引物通用性差，并且扩增时对模板DNA的质量要求高，不适用于存在DNA降解的材料(Kress et al.,2005)，因此，植物中最可能的条形码还是从叶绿体基因组中选择(Chase et al.,2005;Cowan et al.,2006)。,生物条形码联盟(CBOL)最初建议的植物条形码片段均为叶绿体段：matK，rpoC1，rpoB，accD，nhdJ和YCF5。但因为后3个片段在一些主要的植
18、物类群中有缺失，如YCF5在苔藓类植物中缺失，accD在禾本科植物中缺失，而ndhJ在松属植物中缺失，因此它们在第二阶段的更新中已被排除。由于越来越多的研究表明单靠某一个片段不太可能对所有的植物物种进行准确鉴定，研究者又相继提出了不同的片段组合方案。,片段组合方案最早由Kress等(2005)提出。Kress等(2005)通过对53科88属99个物种的9个质体基因片段(trnK-rps16、trnH-psbA、rp136-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)和核基因ITS序列进行分析，提出了片段组合方
19、案,并预测ITS+trnH-psbA组合将在有花植物(flowering plants)中有较广泛的应用价值。,为了寻求一种通用的植物条形码，许多学者进行了积极的探索，已提出了多种条形码片段或组合方法，但至今仍没有达成明确的共识。现有的研究报道了在2种组合方案中选择片段的方法，分别是Chase等(2005)提出的交通灯法(traffic light approach)和Newmaster等(2006)提出的等级(tier)分类法。,2007年9月，在第二届国际生命条形码大会上，总结了5种片段组合：Chase等(2007)提出的rpoC1+rpoB+matK或rpoC1+matK+trnH-ps
20、bA；Kress和Erickson(2007)提出的rbcL+trnH-psbA，其可以对陆生植物进行识别和鉴定。韩国植物学家Ki-Joong Kim等提出的matK+atpF-atpH+psbK-psbI或matK+atpF-atpH+trnHpsbA(Pennisi,2007),Steele等(2010)用5个叶绿体DNA片段组合，对葫芦科Psiguria属的6个种进行了条形码鉴定，发现每个物种均拥有各自独特的条形码。2009年11月7日至13日在墨西哥召开的第三届DNA条形码国际学术大会上，与会者达成共识，一致建议在rbcL和matK之外，选择进化速率较快的ITS和trnH-psbA，探
21、讨它们在陆地植物中的通用性、分辨率和适合程度。,植物基因组的进化与动物基因组的完全不同。动物存在生殖隔离，不同物种的动物无法繁殖杂交后代，可以此为标准鉴定动物物种，但许多植物物种间可以互相杂交，这就模糊了它们之间的遗传边界(genetic boundary)，造成了植物在种的水平上有较大的差异。因此在寻求整个植物界通用的条形码过程中，可首先找出适合于大部分植物的片段或组合，其它少部分则作为特例，再针对不同的科属选择不同的条形码。编码基因通常变异较小，特别是叶绿体基因组相对比较保守，使用编码基因和非编码基因的组合，可能会更好地识别和鉴定物种。多片段组合将是植物条形码选择的最终方案。,六、DNA条
22、形码在药用植物鉴定中的应用,DNA条形码已经在动物中得到广泛应用，在植物中的研究也正在快速开展，这将有助于非分类学专业工作者对有关材料进行快速、准确的鉴定，尤其是对于药材的鉴定。由于各片段(尤其是多片段的组合选择)在不同类群中的应用效果不同，目前尚未获得一致的植物条形码标准片段，因此，当前的研究热点仍然是选择和评价可能的条形码片段，进行更大规模的分析和整体评价。,目前，DNA条形码以其快速、准确和自动化，在生物物种鉴定领域的研究方兴未艾，而在药材鉴定中的应用尚处于萌芽状态。如能将DNA条形码用于市场品种混乱的多来源药材的鉴定，弥补其在药材质量评价方面的不足，形成能够全面反映药材的生物基原、质量
23、、产地等信息的DNA条形码系统，则可以快速准确的鉴定多来源的药材。该系统不仅能够用于药材的鉴定与质量评价，还可以探讨原植物间的亲缘关系及系统发育。,远景预期技术成熟后可形成供企业使用的药材生产标准，在进货时以DNA条形码系统进行质量控制，在药材成品上标识DNA条形码，质检部门可对其进行验证判断真伪及是否符合生药质量标准。随着DNA条形码技术的飞速发展，可以预见地球上几乎所有生物种类都将具备唯一的DNA条形码。该技术有着巨大的应用潜力，不久的将来，手持式快速物种鉴定设备的投入使用将给药材的快速鉴定工作带来巨大的便利。,谢谢,植物DNA条形码技术的应用范畴,1.物种鉴定以及新种和隐种的发现除了可以
24、进行物种鉴定外，利用DNA条形码技术还可以发现许多新种和隐种。例如，Lahaye等单独使用matK片段对分布在中美洲的l000多种兰科植物进行分析，显示单独使用matK片段能够揭示隐种并且证明了DNA条形码的可行性；2010年，Newmaster等通过DNA条形码技术发现了感应草属(Biophytum DC)中的3个隐种，并发现了草沙蚕属(Tripogon Roemet Schuh)的1个新种。协助传统分类方法发现那些形态相似但存在遗传分化的隐种是DNA条形码技术对分类学研究的重要贡献，可显著提高实地生态学考察研究的准确性和效率。,2.用于解决一些生物学问题JuradoRivera等旧副认为：
25、DNA条形码还可用于解决一些复杂的牛物学问题，如寄生关系等。通过扩增草食性动物牛的trnL基因，发现Peltoschema与4种寄生植物关系密切。因此，利用DNA条形码可以正确识别寄生植物并确定营养关系。,3.在民族植物学研究中的应用值得一提的是，DNA条形码技术在民族植物学研究中也得到了一定的应用。民族植物学以传统社会管理和利用的植物为主要研究对象，在研究过程中常常通过借助民间分类学家(parataxonomist)的知识来获得当地人对植物进行分门别类的信息。这些民间分类学家的知识有些是传承自长辈、有些则结合了自己的观察和实践，他们不必像分类学家那样一般需要获得植物的繁殖器官才能有效鉴定物种
26、，而是基于他们长期积累的知识、通过植物某个生长阶段的某个(些)器官(通常是营养器官)，就能准确说出植物的当地名称、生长习性、资源和分布状况、用途和用法等,在开展民族植物学研究的过程中，由植物分类学家和民间分类学家分别获得的植物种数往往存在一定的差异，或前者数量多于后者，或后者数量多于前者。到底哪一个物种数是准确的?在没有足够的时间等待植物开花和结果的情况下，采集植物叶片通过DNA条形码技术进行分类签定，是一种理想的快速鉴别方法。,基于这样的设想，加拿大圭尔夫大学的Newmaster博士及其合作者，将DNA条形码技术应用于民族植物学的研究。印度南部西高止山脉的2个山地部落Irulas和Malas
27、ars把在当地被称为“Sunai pul”的1种草沙蚕属禾草用于祭祀和其他经济用途，这种植物对当地社区居民十分重要，因而当地的民间分类学家(或信息提供者informant)能轻易识别这一物种。有趣的是，这是1个植物分类学上的隐种，植物分类学家难以通过形态特征朱识别。Newmaster等采用DNA条形码技术，不仅证实了民问分类学家鉴定该物种的正确性，而且发现Sunai pul是植物学上的1个新种，将其命名为Tripogon cope Newmaster。因此，他们认为DNA条形码技术可以应用于一些民间分类群(ethnotaxon)的鉴定和识别。Newmaster等还将DNA条形码与基因组学的相关
28、技术相结合，应用于印度一些部落的民间分类群，包括民族药用植物。在此基础上，他们提出了“民族植物基因组学”(ethnobotany genomics)的概念，认为通过民族植物基因组学的研究，可以识别一些隐种，还能确定一些珍稀植物的分布及其生态学特性,隐种crypticspecies亦称“孪生种”。繁殖隔离而形态上几乎无区别的不同物种。隐存是指种群间由于彼此形态的相似性而无法区分，并非指其颜色或形态酷似其生存背景或基底而无法辨认。隐存种在有些生物类群中相当普遍。,清风藤属(Sabia Colebr)中的小花清风藤(Sabiap arviflora Wallex Roxb)是1种非常重要的民间药用植
29、物，被贵州和云南的布依族民众广泛用于治疗黄疸型肝炎、止血和消炎，布依族民众也使用同属植物作为代用品，但是一些形态相似的混淆品已经进入市场。龙春林领导的研究组用trnH-psbA、rbcL和matK片段对6种清风藤属植物和7种市场混淆品进行鉴定，结果表明：这3个DNA片段的扩增成功率和物种识别率都很高，且小花清风藤与同属替代品之间的序列差异率较低(仅为00.00一0.86)，但与混淆品之间的序列差异率却较高(达2450)，说明布依族民众识别清风藤属植物的传统知识是可靠的。研究结果还表明，DNA条形码技术不仅可以有效鉴别市场上小花清风藤的混淆品，而且对民族传统医药文化的保护有重要作用。,4.构建AIT系统2009年，Newmaster等提出开发和研制AIT(automated identification technology)系统，即：将1片未知的植物叶片插入AIT机，通过无线网络，就可以获得该叶片所代表植物的名称、分布、化学成分、食用价值等，既省时又经济，可代替昂贵又费时的传统分类方法，同时也减少了通过形态特征识别物种的一些限制因素。预计AIT系统可能会给生物界带来革命性的改变，也会对人类社会产生重要影响。,
