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1、分子生物学,玉林师范学院生命科学与技术学院 林谦2013.9.,第5章 DNA的损伤、修复和突变 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，因此维护DNA分子的完整性对细胞至关重要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变，而且与RNA及蛋白质可以在胞内大量合成不同，一般在一个原核细胞中只有一份DNA，在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对，如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正，对体细胞就可能影响其功能或生存，对生殖细胞则可能影响到后代。,DNA损伤的后果,所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要，也是生物能保持遗传稳定性之奥秘所在。在细胞
2、中能进行修复的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA对生命的重要性。另一方面，在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象，DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，正因为如此生物才会有变异、有进化。,5.1 DNA损伤及其修复 DNA与其他生物大分子一样会遇到各种因素造成的损伤。DNA损伤如果不修复，不仅会影响到DNA的复制和转录，还可能导致细胞的癌变或早衰甚至死亡。为避免DNA损伤的不良后果，细胞往往会尽量修复DNA损伤，而不是简单地将其水解，因为一个细胞内的同一种DNA分子不像蛋白质和RNA那样有多个拷贝，如果将其水解，细胞也就失去了存在的基础；此外，DNA的互补双螺旋结构使
3、受损伤的DNA分子很容易修复。,5.1.1 导致DNA损伤的因素及损伤类型 导致DNA损伤的因素包括细胞内的和环境中的因素。细胞内的因素：DNA结构本身的不稳定；DNA复制过程中自然发生的错误，主要是碱基错配；细胞内活性氧(ROS)带来的破坏作用。环境因素：化学因素化学诱变剂；物理因素紫外辐射、离子辐射。DNA损伤可分为碱基损伤和DNA链的损伤。,图5-1 DNA分子上可能遭遇到的各种损伤,碱基损伤有5个亚类碱基丢失 由水分子进攻DNA分子上连接碱基和核糖间的糖苷键引起，以脱嘌呤最为普遍。黄曲霉毒素B1能加剧此反应，导致癌症。(2)碱基转换 含有氨基的碱基自发地或在某些化学试剂的作用下发生了脱
4、氨基反应。(3)碱基修饰 某些试剂直接作用碱基，如烷基化试剂修饰鸟嘌呤产生6-烷基鸟嘌呤，活性氧ROS修饰鸟嘌呤和胸腺嘧啶分别产生8-氧鸟嘌呤和胸腺嘧啶乙二醇。,图5-2 活性氧造成的碱基损伤,(4)碱基交联 紫外线照射可导致DNA链上相邻的嘧啶碱基，主要是T之间形成环丁烷嘧啶二聚体或6-4光产物。,(5)碱基错配 引起错配的原因有DNA复制过程中4种脱氧核苷三磷酸浓度的失调、碱基的互变异构或碱基之间的差别不足以让聚合酶正确区分。尽管聚合酶可纠正大部分错配的碱基，但仍有“漏网之鱼”。,DNA链的损伤又分为3个亚类：(1)链的断裂 单链断裂和双链断裂，由离子辐射(X射线、射线)和某些化学试剂的作
5、用，如博来霉素。链断裂是极严重的损伤，当DNA出现太多的裂口(特别是双链裂口)时，往往难以修复，导致细胞死亡。癌症放疗的原理就在于此。(2)DNA链的交联 一些双功能试剂导致DNA发生链间交联，如顺铂和丝裂霉素。(3)DNA与蛋白质之间的交联 紫外线可诱导DNA与结合在其上的蛋白质之间形成共价交联。,图5-4 离子辐射引起的DNA链断裂,5.1.2 DNA的修复机制 尽管DNA损伤的形式很多，但细胞内存在十分完善的修复系统。基本上每一种损伤在细胞内都有相应的修复系统(有时不止一种)。细胞内的绝大多数修复系统将损伤的核苷酸与周围的正常核苷酸一起切除，以另一条互补链上正常的核苷酸序列为模板，重新合
6、成核苷酸，取代原来异常的核苷酸。,5.1.2.1 直接修复 也称损伤逆转，不切除受损伤的碱基，而是直接将其逆转为正常的碱基。5.1.2.1.1 嘧啶二聚体的直接修复 嘧啶二聚体是一种极常见的损伤，导致DNA双螺旋发生扭曲，影响到DNA复制和转录。既可被直接修复，也可被切除修复。参与直接修复的是DNA光复活酶(photoreactivating enzyme)或光裂解酶(photolyase)。,在可见光的存在下，DNA光解酶(photolyase，光复活酶)可将 环丁烷二聚体再分解为单体。这些酶含有可吸收蓝光并将能量转移到待切环丁烷环中的辅基。E.coli 的光解酶含有2个色素分子，N5，N1
7、0-次甲基四氢叶酸和还原性的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。光复活对嘧啶二聚体是专一性的。是损伤被“直接修复”的一种例子，是无差错的。,光复活是针对紫外线引起DNA损伤而形成的胸腺嘧啶二聚体，在损伤部位进行修复的修复途径。光复活作用在可见光的活化下，由光复活酶(PR酶,又称光解酶)，催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体。PR酶先与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物；复合物以某种方式吸收可见光，并利用光能切断二聚体之间的两个C-C键，使胸腺嘧啶二聚体变为两个单体，恢复正常，而后PR酶就从DNA上解离下来。,图5-5 嘧啶二聚体的直接修复,5.1.2.1.2 烷基化碱基的直接修复 烷基转移酶参与烷基化
8、碱基的修复。大肠杆菌中，6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(Ada酶)直接修复6-甲基鸟嘌呤、4-烷基胸腺嘧啶和甲基化的磷酸二酯键。Ada酶以活性中心的1个Cys残基作为甲基受体，一旦得到甲基就失活，因此是一种自杀酶。MGMT-II是另一种烷基转移酶。5.1.2.1.3 DNA链断裂的直接修复 这种修复由DNA连接酶催化，但裂口必须正好是DNA连接酶的底物，即相邻的5-P和3-OH。,烷基转移酶,无差错直接修复,损伤：烷化剂使鸟嘌呤或 O6位甲基化，改变它的配对性质。修复：烷基转移酶特异性地转移O6 甲基鸟嘌呤或 O6 乙基鸟嘌呤上的甲基或乙基基团到酶分子的半胱氨酸上，从而修复DNA损伤。,图5-6 烷
9、基化碱基的直接修复,5.1.2.2 切除修复 先切除受损的碱基或核苷酸，重新合成正常的核苷酸，再经连接酶重新连接，前后经历识别、切除、重新合成和重新连接四步。由于这些酶的作用不需可见光激活，也叫暗修复。切除修复不仅能消除由紫外线引起的损伤，也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。切除修复一般发生在下一轮DNA复制之前，又称复制前修复。切除修复分为碱基切除修复(BER)和核苷酸切除修复(NER)。BER直接识别具体的受损碱基，识别的标记是受损碱基的化学变化，而NER识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲。BER中还有一类专门修复DNA复制中产生错配碱基对的机制，称为错配修复(MMR)。,切除
10、修复属于Error-free repair无差错修复Base excision repair(BER，碱基切除修复)Uracil-DNA N glycosylase system(糖苷酶系统)Nucleotide Excision Repair(NER，核苷酸切除修复)E.coli UvrABC endonuclease 系统 切除修复是修复DNA损伤最为普遍的方式。对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用。,DNA的损伤和切除修复,碱基
11、丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,修复,连接,糖苷酶,切除,图5-8 尿嘧啶的切除修复,5.1.2.2.1 BER DNA糖苷酶切除受损的碱基，产生无嘌呤或无嘧啶位点(AP site)。AP内切酶在此AP site上游切开DNA链，随后在DNA聚合酶催化下，切口的3-OH端进行DNA的修复合成，模板是另一条链上的无损伤的互补序列。,图5-10 真核细胞的碱基切除修复,5.1.2.2.2 NER NER主要用来修复导致DNA结构发生扭曲并影响到DNA复制的损伤，如可造成DNA发生大约30度弯曲的嘧啶二
12、聚体，此外，大约20%由ROS造成的碱基氧化性损伤也由它修复。NER识别损伤并不针对损伤本身，而是针对损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲，故许多不同的损伤能被相同的机制和几乎同一套修复蛋白修复。,28,DNA聚合酶,DNA连接酶,DNA解旋酶,human excinuclease,DNA损伤,Nucleotide excision repair,人类核酸切除酶,探测损伤。由特殊的蛋白质完成并由此引发一系列的蛋白质与受损DNA的有序结合。切开损伤链。特殊的内切酶在损伤部位的两侧DNA链，损伤以寡聚核苷酸的形式被切除。去除损伤。2个切口之间的带有损伤的DNA片段被去除。填补缺口。由DNA聚合酶完成。
13、缝合切口。由DNA连接酶完成。,核苷酸切除修复(NER)主要用来修复导致DNA结构发生扭曲并影响到DNA复制的损伤。NER可分为全局性基因组NER(GGR)和转录偶联性NER(TCR)。GGR负责修复整个基因组的损伤，速度慢，效率低；TCR专门修复那些正在转录的基因在模板链上的损伤，速度快，效率高。,图5-12 E.coli核苷酸切除修复的详细过程,UvrA:损伤识别，充当分子接头UvrB:损伤识别，具有ATP酶和核酸内切酶活性UvrC:具有内切核酸酶活性UvrD:II型解链酶DNA聚合酶I/II：填补空缺DNA连接酶：缝合切口,图5-14 哺乳动物细胞的GGR和TCR,MMR(mismatc
14、h repair)错配修复是在含有错配碱基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢复的修复方式；主要用来纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，还能修复一些因复制打滑而产生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。现已在大肠杆菌、酵母和哺乳动物中发现了这一系统。MMR的过程需要区分母链和子链，做到只切除子链上错误的核苷酸，而不会切除母链上本来就正常的核苷酸。修复的过程是：识别出正确的链，切除掉不正确的部分，然后通过DNA聚合酶III和DNA连接酶的作用，合成正确配对的双链DNA。,修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链，这是通过碱基的甲基化来实现的。半甲基化DNA成为识别模板链和新合成链的基础。错配修复发生在GAT
15、C的邻近处，故这种修复也称为甲基指导的错配修复。错配修复是一个低效率、高耗能的过程。所有错配都可由这一系统修复，但其中以GT错配修复更为有效，CC错配的修复为弱。,35,如何识别新链和旧链？,Methyl group,Not methylated yet,Parent,New,Hemi-methylation,图5-15 E.coli错配修复的详细过程,MutS:识别错配碱基，具有弱ATP酶活性MutL:调节MutS和MutH之间的相互作用，与UvrD作用MutH:结合半甲基化的GATC位点，序列和甲基化特异性内切酶，剪切非甲基化GATC的5-端UvrD:解链酶，催化被切开的含有错配碱基的子链
16、与母链的分离,5.1.2.3 DSBR(Double-stranded break repair)DNA断裂特别是双链断裂是一种极严重的损伤。这种损伤难以彻底修复，因为双链断裂修复难以找到互补链来提供修复断裂的遗传信息。细胞主要用两种机制来修复DNA双链断裂：第一种是同源重组，通过同源重组从同源染色体那里获得合适的修复断裂的信息，精确度较高；第二种称为非同源末端连接(NHEJ)，在无序列同源的情况下，让断裂的末端重新连接起来，精确性低，是人类修复双链断裂的主要方式。,图5-16 哺乳动物细胞DNA双链断裂的非同源末端连接,5.1.2.4 损伤跨越 当损伤无法修复(如复制叉已经解开了母链，致使切
17、除修复系统无法利用互补链作为修复合成的模板)，或者修复系统还没有机会去修复，细胞利用两套相对独立的损伤跨越修复系统重组跨越、跨越合成，先不管损伤，设法完成复制。,5.1.2.4.1 重组跨越 重组跨越又称为重组修复，利用同源重组的方法将DNA模板进行交换以克服损伤对复制的障碍，而随后的复制仍然使用细胞内高保真的聚合酶。是一种无错修复，因为忠实性未受到影响。以大肠杆菌为例，一旦复制叉到达损伤位点，DNA聚合酶III即停止移动，随后与模板链解离，在损伤点下游约1kb的地方重启DNA复制，在子链上留下一段空缺。在RecA蛋白的催化下，原DNA的一条母链(与新合成的子链序列一致)的同源片段被重组到子代
18、DNA上，填补子链的空缺，但在母链上产生新的空缺。,图5-17 E.coli的重组跨越,受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。完整的另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。,重组修复在DNA损伤未被切除或修复的情况下使细胞恢复DNA复制，等到复制完成后再通过其他机理修复残留的损伤，这种修复方式称为复制后修复。重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是
19、重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“稀释”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。,重组修复与切除修复的最大区别在于前者不须立即从亲代的DNA分子中去除受损伤的部分,却能保证DNA复制继续进行。原母链中遗留的损伤部分,可以在下一个细胞周期中再以切除修复方式去完成修复。,5.1.2.4.2 跨越合成 跨越合成又称为跨损伤合成TLS，由特殊的DNA聚合酶取代停留在损伤位点上的催化复制的DNA聚合酶，在子链上(模板链上损伤碱基的对面)随机插入核苷酸(正确或错误的)，以实现对损伤位点无错或易错的修复。,(1)大肠杆菌的跨越合成 大肠杆菌的TLS是其SOS反应的一
20、部分，属于一种可诱导的过程。SOS反应指细胞在受到潜在致死性压力后，做出的有利于细胞生存、但以突变为代价的代谢预警反应，包括易错的TLS、细胞丝状化(细胞伸长，但不分裂)和切除修复系统的激活，其中涉及到近20个sos基因的表达，整个反应受到阻遏蛋白LexA和激活蛋白RecA的调节。“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS系统只在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制时才出现，代价是保真度降低“好死不如赖活着”。,大肠杆菌在正常的生长条件下，LexA蛋白与20个sos基因的上游的一段被称为SOS盒子的操纵基因结合，阻止这些基因的表达；当细胞面临致死性压力，其DNA遭遇到严重损伤而出现单链缺口的情
21、况下，RecA蛋白被单链DNA激活后作用于LexA蛋白，使LexA蛋白发生自我切割，失去与sos基因的操纵基因结合的活性，解除其对sos基因表达的抑制。,SOS 修复无模板指导的DNA复制,大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生,SOS系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行,RecA-P;三种功能,SOS修复酶只有在细胞受到损伤时才存在(正常细胞中不存在)机制a、SOS系统以某种方式对pol进行修饰(改变校对亚基功能)b、由pol负责超越创伤复制结果大量的没有被错配修复系统和切除修复系统纠正的错误碱基导致突变错误倾向性存活下来总比死亡好,当DNA复制度过难关后,SOS修复是一种旁路系统，它允许
22、新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长，其代价是保真度的极大降低，这是一种易错修复系统。SOS修复是SOS反应的一种功能。SOS反应是DNA受到损伤或脱氧核糖核酸的复制受阻时的一种诱导反应。SOS反应机制：在潜在的致死压力下，细胞的新陈代谢系统帮助细胞存活。,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),图5-18 E.coli的SOS反应,图5-19 E.coli DNA损伤的跨越合成,图5-20 DNA polV参与的跨损伤合成的详细步骤,图5-2
23、1 酵母细胞DNA的两种跨损伤合成机制,真核生物TLS的方式有两种：一种无错，另一种易错。细胞选择哪一种方式，取决于损伤的类型以及细胞内各种参与TLS的聚合酶之间的相对活性。,5.1.2.5 DNA修复缺陷与癌症的关系 DNA修复系统在维持DNA的完整性和稳定性上具有非常重要的作用，当复制系统出现故障，机体会产生各种遗传性疾病或癌症。人类遗传性疾病已发现4000多种，其中不少与DNA修复缺陷有关，这些DNA修复缺陷的细胞表现出对辐射和致癌剂的敏感性增加。例:紫外线所致的基因突变，290-320nm 由于修复系统的缺陷或偶发的错误修复，会导致某些基因突变，使得角质形成细胞的细胞周期的调控出现异常
24、，进一步发生克隆性增生和永生化生长而导致皮肤癌的发生。,管理基因(caretaker genes):执行DNA的损伤修复，维持基因组的完整性。如着色性干皮病的修复基因XPAXPF。看门基因(gatekeeper genes):控制细胞信号传导，调控细胞的增殖、分化和凋亡。如p53、patched基因和ras等。皮肤癌的发生与看门基因突变关系密切。,着色性干皮病,xerodermapigmentosis,着色性干皮病(XP)是一种常染色体隐性遗传病。患者皮肤对日光过度敏感，暴露部位的皮肤易发生色素沉着、萎缩、角化过度和癌变等。其病因是患者DNA切除修复酶系统的功能缺陷或降低。XP患者缺乏对包括由
25、紫外线引起的大块DNA损伤的核苷酸切除功能，至少有7种不同基因的缺陷可导致XP。50以上的XP患者与De Sacchione综合症相关，此综合症包括：性发育不良，生长迟缓，伴智力障碍的神经异常，小头和感觉神经性耳聋，神经异常与尸体解剖中发现的中枢和外周神经系统过早神经原死亡有关。,主要特征是皮肤光敏和早发性肉瘤，初期表现为皮肤病症状，如光敏、雀斑、角化、毛细血管扩张、皮肤癌(黑素瘤、鳞状基底细胞瘤)。神经系统症状包括精神发育迟滞、痴呆、周围神经病、共济失调、舞蹈手足动症、癫痫发作、痉挛性四肢瘫、耳聋、头及身材矮小和性腺发育不足等。皮肤损伤于婴儿期出现，神经系统症状在30岁以前逐步发展，患者在1
26、120岁时可因转移性肿瘤而死亡。病检可见大脑、小脑、脑干神经元变性缺失。病检基因 XP分7个互补组(A-G)，6个已被克隆，即XPA、ERCC-3、XPC、ERCC-2、ERCC-4、ERCC-5。,p53 当UVB损伤DNA造成p53突变后，突变型p53因失去了对细胞周期的正常调控，使得损伤的DNA继续复制，从而提高了染色体畸变的偶发率和遗传的不稳定性，角质形成细胞极易发生克隆增生和恶性转化。,5.2 DNA的突变 当DNA遭到损伤后，如果修复系统在下一次复制前未能将其修复，这些损伤将传给子代。发生在DNA分子上可遗传的永久性结构变化通称为突变(mutation)。发生突变的基因、基因组、细
27、胞或个体称为突变体(mutant)。对于多细胞动物来说，只有影响到生殖细胞的突变才具有进化层次上的意义。对细菌、原生动物、植物和真菌而言，发生在体细胞的突变一样可以传给后代。,正常人约有1014个细胞，在人的整个一生中约进行1016次细胞分裂，人体的自发突变频率约为1.410-10，实际上加上辐射和自然界普遍存在的致突变剂的影响，突变频率要远高于这个数值。如果单个突变可以致癌，仅据自发突变率计算，人一生中大约有28细胞将癌变，那么癌症将是日常事件。,5.2.1 突变的类型与后果 DNA突变可分为点突变(point mutation)和移码突变(frameshift mutation)。突变并不
28、总是导致表现型的变化，因为一些突变位点没有影响到基因的功能或表达，或者高一级的基因组功能(如DNA复制)。这样的突变从进化的角度看属于中性的(neutral)，因为它并没有影响到个体的生存和适应能力。,5.2.1.1 点突变 点突变也称为简单突变或单一位点突变，最主要的形式为碱基对置换，包括转换(transitions)和颠换(transversions)两种形式。转换指一种嘧啶变成另一种嘧啶，或一种嘌呤变成另一种嘌呤，颠换指嘧啶和嘌呤之间的互变。,如果点突变发生在基因组的垃圾DNA上，就可能不产生任何后果，因为其上的碱基序列缺乏编码和调节基因表达的功能；如果发生在一个基因的启动子或其他调节基
29、因表达的区域，则可能会影响到基因表达的效率；如果发生在一个基因的内部，则突变后果取决于该突变基因是RNA基因还是蛋白质基因，如果是蛋白质基因，又取决于是编码区还是非编码区。,图5-22 碱基突变的几种方式,(1)同义突变或沉默突变 突变的密码子所编码的氨基酸并没改变，这种突变称同义突变。,(2)、错义突变 基因编码序列中碱基的置换发生在密码子的第1或第2位碱基，导致密码子改变，并编码另一种氨基酸，这种突变称错义突变。如果错误的氨基酸与原来的氨基酸属于同种性质，则称为中性突变。如果突变的后果只在某种条件下显现，则将此类突变体称为条件突变体。,(3)、无义突变：指基因编码序列中碱基置换使氨基酸密码
30、子转变为终止密码子的突变称为无义突变。TAG琥珀型突变 TAA赫石型突变 TGA乳白型突变,如果终止密码子突变成编码氨基酸的密码子，则会使突变的mRNA在翻译时发生通读，使肽链加长，因此称为加长突变(elongation mutations)或通读突变(read-through mutations)。如TAG突变成CAG，原来应该翻译终止的地方却变成了Gln。加长突变可能会改变多肽的性质，如影响其稳定性。但多肽链一般不会加得很长，因为通常在原来的终止密码子下游还存在其他天然的终止密码子。,5.2.1.2 移码突变 移码突变或移框突变，指在一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸(非3的整数
31、倍)的缺失或插入。翻译的阅读框改变，致使插入点或缺失点下游的氨基酸序列发生根本性的变化，但也可能会提前引入终止密码子而使多肽链被截短。突变位置离起始密码子越近，功能丧失的可能性就越大。,图5-23 移码突变,5.2.1.3 隐性突变和显性突变 如果一条染色体中的DNA发生突变，表型不发生改变，只有在两条染色体的DNA均发生突变时才会出现表型的变化，这样的突变就是隐性突变。如果一条染色体的DNA突变即可导致表型改变，这样的突变就是显性突变。,图5-24 隐性突变和显性突变,5.2.2 突变的原因 几乎任何导致DNA损伤的因素都可能成为DNA突变的诱因，前提是它们造成的损伤在DNA复制前还没有被体
32、内的修复系统修复。因此，导致DNA损伤的因素都可同样导致DNA突变。由内部因素引起的突变称为自发突变，由外部因素引起的突变称为诱发突变。导致DNA突变的因素称为突变原。,5.2.2.1 自发突变5.2.2.1.1 自发点突变 导致自发点突变的原因有(1)DNA复制过程中的错配(2)自发脱氨基 DNA分子中的胞嘧啶容易发生自发脱氨基反应，胞嘧啶脱氨基后变成尿嘧啶，细胞内的BER系统很容易修复。真核细胞DNA中含有很多修饰的5-甲基胞嘧啶，可自发脱氨基则变成胸腺嘧啶，细胞无法纠正，在下一轮复制时，将导致C:G变成T:A。,(3)ROS的氧化 细胞正常代谢产生的ROS对碱基造成的损伤能改变碱基的配对
33、性质。如活性氧作用于鸟嘌呤的产物8-氧鸟嘌呤与A配对，导致G:C碱基对到T:A碱基对的颠换。ROS由正常的细胞代谢产生，线粒体利用细胞85%的O2，是主要的ROS来源，导致DNA、蛋白质和脂质损伤。常见的形式：过氧化氢(H2O2)、超氧化物自由基(O2-)、一氧化氮(NO)、羟基自由基(HO)、过氧亚硝基阴离子(O=NOO-)、烷过氧化物(ROOH)、烷氧自由基(RO)。(4)碱基的烷基化 细胞内一些天然的烷基化试剂(如S-腺苷甲硫氨酸)引起的DNA上某些碱基的甲基化，改变了碱基的配对性质。,图5-25 自发脱氨基和活性氧作用引起的碱基转换,5.2.2.1.2 自发的移码突变(1)复制打滑 当
34、DNA聚合酶拷贝到一些具有短重复序列区域(如微卫星序列)时，子链和母链之间容易发生错配而形成突环结构。如果突环出现在子链上，复制就会向后打滑，导致插入突变；如果突环出现在母链上，复制就会向前打滑，导致缺失突变。,图5-26 复制打滑引起的插入或缺失突变,如果这种突变发生在一个基因的编码区，将可能产生异常的蛋白质，导致机体病变。如亨廷顿氏病(Huntingtons disease)是CAG重复序列在HD基因的编码区因复制打滑增多造成的。正常人的HD基因在编码区内有1035个CAG重复序列，但亨廷顿氏病患者的HD基因内的CAG重复序列高达3675个，甚至更多。该突变蛋白质的形状发生改变，并在神经元
35、内形成大的丛群。这将杀灭大脑纹状体部位的这些细胞，从而导致特有的协调力丧失和痴呆症。初期为轻度的认知障碍，随后出现进行性加重的舞蹈样动作，也可出现一些精神症状。,(2)转座子的转座作用 转座子是细胞内可移动的DNA片段，很容易导致突变的发生。当一个基因内部被转座子插入后，不仅会引起移码突变，还可能导致基因的中断和失活等其他变化。,5.2.2.2 诱发突变5.2.2.2.1 诱发点突变 能够诱发点突变的突变原有以下几类：(1)碱基类似物 碱基类似物与天然的碱基在结构上十分相似，如5-溴尿嘧啶与T相似，2-氨基嘌呤与A相似。它们在DNA复制过程以假乱真进入DNA链，导致碱基对变化。5-BU是胸腺嘧
36、啶(T)的结构类似物，酮式结构易与A配对；烯醇式结构易与G配对。2-氨基嘌呤可代替A进入DNA链中，它既可与T配对又可与C配对。,图5-27 5-溴尿嘧啶诱发的点突变,(2)烷基化试剂 烷基化试剂(如氮芥和硫芥等)能够通过修饰碱基而改变被修饰碱基的配对性质，从而将碱基对的转换引入DNA分子中。6-甲基鸟嘌呤可与T配对，导致G:C变成A:T。(3)脱氨基试剂 亚硝酸可促进C、A、G脱氨基，转变成尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤。黄嘌呤的配对性质与G相同，尿嘧啶、次黄嘌呤的配对性质发生变化，导致碱基对的转换。(4)羟胺 羟胺在细胞内能直接修饰碱基，改变其配对性质，导致碱基对的转换。例如，C经羟胺的修饰变成
37、能与A配对的羟胞嘧啶，最终导致C:G变成T:A。,图5-28 诱变剂诱发的点突变,5.2.2.2.2 诱发移码突变 DNA嵌入试剂，如吖啶黄、原黄素、溴化乙锭等，都是扁平的多环分子，能与DNA分子中的碱基杂环相互作用，插入到碱基之间，拉长双螺旋，并骗过DNA聚合酶，致使DNA在复制时发生移码突变。如果嵌入试剂插入到复制的模板链上，则会在子链上、嵌入试剂分子的对面随机插入一个核苷酸，诱发插入突变；相反，如果嵌入试剂分子插入到一个正在延伸的子链上，那么在进行下一轮复制的时候，一旦嵌入分子脱落，将会导致缺失突变。,图5-29 嵌入试剂诱发的移框突变,图5-30 各种化学诱变剂化学结构,马兜铃酸是现今
38、已知最强的致癌物质 2013年8月7日，美国、新加坡和台湾多个医学中心科学家发布了关于马兜铃酸的致癌性研究报告，并同步在线发表于科学-转化医学网站首页显著位置。尿道上皮细胞癌细胞基因突变率达每百万个碱基对150个突变点，高于紫外线诱发黑色素细胞瘤的111个突变点，更显著高于众所周知的吸烟诱发肺癌的8个突变点。,早在上世纪90年代，国际学术界就发现马兜铃酸可以导致不可逆性肾病以及尿道上皮细胞癌。1999年英国率先全面禁用所有含马兜铃酸的中草药，2000年世界卫生组织(WHO)发出警示并指明马兜铃酸是一种潜在的致癌物质，随后的2001年到2005年间欧美以及世界上许多国家、地区，包括我国台湾和香港
39、，先后全面禁用所有含有马兜铃酸的中草药。2009年，WHO将马兜铃酸列为 一级致癌物。小剂量马兜铃酸即可引起肾脏不可逆损伤，大剂量则直接引起急性肾小管上皮细胞坏死，并进而发生肾间质纤维化，导致肾衰竭。无论是肾病还是癌症，目前均无有效的根治方法。因此，要避免摄入马兜铃酸。,马兜铃酸在我国也曾引起了轰动一时的所谓“龙胆泻肝丸事件”，但是最终结果很遗憾，作为一个人口超过13亿国家的食品药品监管机构CFDA(即原SFDA)，不是基于保护民众身体健康和用药安全原则，而是为了保护和支持中医药事业，仅仅象征性地取消了关木通、广防己、青木香这三种中药材的用药标准，而更多的含有马兜铃酸的中药材却仍在广泛使用。据
40、不完全统计，明确或者可能含有马兜铃酸的、并仍在使用的中药材有朱砂莲、天仙藤、细辛、寻骨风、马兜铃、汉中防己、追风藤、淮通、三筒管、杜衡、管南香、南木香、藤香、背蛇生、假大薯、蝴蝶暗消、逼血雷、白金果榄、金耳环、乌金草、威灵仙等，多达数十种，而用这些中药材制成的中成药更是数以百计。,部分含有马兜铃酸的中成药：伊痛舒注射液、猴枣牛黄散、小儿咳喘冲剂/颗粒、儿童清肺丸、儿童清肺口服液、小儿保安丸、八宝镇惊丸、惊风丸、鸬鹚涎丸、小儿肺闭宁片、九龙化风丸、解暑片、镇惊散、参三七伤药/散/片、小儿治哮灵片、羊痫疯癫丸、珠贝定喘丸、京制咳嗽痰喘丸、感特灵胶囊、川芎茶调冲剂、复方半夏片、风湿安泰片、醒脑再造胶
41、囊、伤痛宁片、追风透骨片、两面针镇痛片、跳骨片、六经头痛片、镇脑宁胶囊、杜仲壮骨胶囊、寒湿痹颗粒/片/胶囊、无敌丹胶囊、人参再造丸、回天再造丸、疏风再造丸、大/小活络丸、大/小活络丸、正天丸、风湿酒、状元红药酒、壮骨酒、止嗽化痰颗粒、复方蛇胆川贝散、消咳平喘口服液、复方胃痛胶囊、三蛇药酒、祛风除湿药酒。,5.2.3 正向突变、回复突变与突变的校正5.2.3.1 正向突变和回复突变 由于基因突变而使生物体的性状由野生型改变为突变型，则将这样的突变称作正向突变(forward mutation)。若已经发生了突变的生物体，经过第二次突变，其性状由突变型恢复到原来的野生型，则其第二次突变称回复突变(
42、reverse mutation或back mutation)。回复突变可能是因为第一次突变形成的错误氨基酸，经第二次突变恢复成原来的氨基酸，或者性质相近的氨基酸，从而使突变体的蛋白质功能得到部分或完全恢复。,图5-31 回复突变,5.2.3.2 校正突变 校正突变(suppressor mutation)指发生在另外一个位点上，且能够中和或抵消起始突变的第二次突变，有时被称为假回复突变(pseudo-reverse mutation)。校正突变可分为基因内校正、基因间校正。,5.2.3.2.1 基因内校正 基因内校正(intragenic suppressors)的第二次突变与起始突变发生在
43、相同的基因内，两次突变一般为同一种类型。这一类校正突变一般是通过恢复一个基因产物内2个残基(氨基酸残基或核苷酸残基)之间的结构联系来实现的。如一个蛋白质的正确折叠需要Lys3残基和Glu50残基侧链之间的离子键，如果起始突变使Lys3残基突变成Glu3残基，将会导致蛋白质因不能正确折叠而丧失功能。若校正突变使Glu50残基变成了Lys50，则可以恢复Glu残基与Lys残基之间的离子键，使突变的蛋白质仍然能够正确折叠，并恢复原有的功能。如果起始突变为移码突变，则校正突变也应当是移码突变，而且移码的位置接近，方向相反，核苷酸数目相同。,图5-32 基因内校正,5.2.3.2.2 基因间校正 基因间
44、校正(intergenic suppressors)发生在另一个与第一次突变不同的基因上，绝大多数是在翻译水平上起作用。发生第二次突变，且具有校正功能的基因被称为校正基因(suppressor gene)。一般而言，每一种校正基因只能校正无义突变、错义突变或移码突变中的一种。校正基因一般是通过恢复2个不同基因产物之间的功能关系来发挥作用的，如恢复2条不同的多肽链之间，2个不同的RNA之间，或者1条多肽链和1分子RNA之间的功能关系。,(1)无义突变的校正 如果mRNA上一个特定的密码子发生无义突变，那么校正突变就发生在DNA上编码野生型tRNA的反密码子上，使发生突变的密码子能被突变的tRNA识别，结果依然能够被翻译成正常的氨基酸。例如，一个tRNATyr的反密码子发生突变，从GUA颠换成CUA，这样的突变使其能识别一个mRNA分子上因突变产生的终止密码子TAG(由一个Tyr的密码子TAC颠换而成)，于是原来的无义突变得到校正。,图5-33 基因间校正,(2)错义突变的校正 对于这种形式的校正还不完全了解，一般指一个异常的tRNA(突变产生)能阅读一个mRNA上错误的密码子而导致正常的氨基酸参入。(3)迂回校正(bypass suppressor)迂回校正是一种生理意义上的校正，该机制通常适用于一条调控途径。,图5-34 迂回校正,
