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1、HER2免疫组化检测的质量控制,苏州大学附属第一医院郭凌川,1,内容提要,HER2检测的质量控制和质量保证HER2检测质量的影响因素检测前检测中检测后HER2检测的质量保证内部质保外部质保Ring研究,HER2检测的质量控制和质量保证,3,质量体系定义,质量控制（QC）用以确保HER2检测结果正确性的内部验证步骤质量保证（QA）通过与其他实验室检测结果相比较而得到的检测技术评价的方式（例如，外部控制）,Bilous M,et al.Mod Path 2003;16:173182.,质量控制与质量保证有何区别？,质控达到和/或维持目标质量在检测中每个步骤均进行样品检查，从而决定是否进行相关改进操
2、作步骤的内部验证每批实验都应进行确保每个检测结果均准确,质保旨在改善总体检测操作与其他检测中心相比较,质控/质保原则（推荐）,Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd;Bilous M et al.Mod Pathol 2003;16:173182.2003.,质控/质保原则（推荐）,Adapted by permission from Macmillan Publishers Ltd;Bilous M et al.Mod Pathol 2003;16:173182.2003.,HER2检测质量的影响因素,8,影响IHC检测结果之常
3、见问题,诸多因素会影响IHC结果的评估,标本固定较差1染色不均,细胞质染色,IHC 02弥散性非均一性细胞质染色,标本点状假阳性染色2棕色点状染色为胞质染色而非胞膜染色,标本边缘假阳性染色1肿瘤标本边缘染色而中心无染色,W Hanna供图;Dako供图.,影响FISH检测结果之常见问题,标本制备染色步骤,固定不完全1片状染色;信号较弱或缺失,过分固定1持续性自发性荧光;信号较弱或缺失,消化封闭不完全2较强自发性荧光；背景亦呈现较强非特异性染色,Abbott供图;2.Ventana供图.,取样,组织处理,固定方式,检测仪器精准度,实验室步骤,固定时间,检测方法验证,检测人员,抗原修复类型,实验试
4、剂,对照,实验条件,使用图像分析,判读标准,报告内容,评分系统,HER2检测偏倚,检测后,检测前,检测中,影响HER2检测结果之因素,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,HER2检测的影响因素：检测前,12,影响HER2检测结果之因素:检测前,取样,组织处理,固定方式,固定时间,Pre-analytic,HER2检测偏倚,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,检测前,取样原发性乳腺癌最好为手术切除而非活检标本，包含癌旁乳腺组织避免细针穿刺活检取样转移性乳腺癌穿刺活检取样胃癌经内镜活检取样或经手
5、术切除之标本,影响HER2检测结果之因素:检测前,取样,HER2检测偏倚,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,HER2检测偏倚,影响HER2检测结果之因素:检测前,组织处理方式提供新鲜及已定位之标本或切除后迅速经甲醛固定之标本立即转送至备检实验室:尽量缩短从标本切除至浸入10%NBF固定之间的时间，通常控制在2030分钟以内乳腺癌：最多1小时胃癌：2030分钟之内,从手术切除到实验室接收之间的组织处理不当会造成不理想和不一致的HER2检测结果 最坏的情况下，检测有可能失败,组织处理,HER2检测偏倚,HER2检测偏倚,Wolff AC,et
6、al.J Clin Oncol 2007;25:118145;乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂志 2009,38(12):836840.胃癌HER2检测指南编写组 胃癌HER2检测指南 中华病理学杂志 2011;40(8):553-557.,影响HER2检测结果之因素:检测前,固定时间乳腺癌最少6小时不超过48小时胃癌穿刺活检最少1小时（以便充分固定）比较大的样本需要至少8小时不超过48小时,固定时间,HER2检测偏倚,HER2检测偏倚,乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂200
7、9;38(12):836840.胃癌HER2检测指南编写组 胃癌HER2检测指南 中华病理学杂志 2011;40(8):553-557.,影响HER2检测结果之因素:检测前,固定方式 首选10%中性缓冲福尔马林（NBF）10%NBF相当于4%甲醛溶液,固定方式,HER2检测偏倚,HER2检测偏倚,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,HER2检测的影响因素：检测中,18,影响HER2检测结果之因素：检测中,检测仪器精准度,实验室检测步骤,检测人员,抗原修复类型,实验试剂,对照,实验条件,HER2检测偏倚,检测中,Wolff AC,et al.J
8、 Clin Oncol 2007;25:118145.,检测方法验证,影响HER2检测结果之因素：检测中,验证检测方法用于检测之实验步骤应经已知实验结果验证标准化实验条件需经标准化试验方法验证后才可常规应用,检测方法验证,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,影响HER2检测结果之因素：检测中,检测仪器之精准度应有常规校准及维护检测仪器的相关操作流程移液器孵育箱水浴锅 温度计,检测仪器精准性,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,仪器准确度指该实验仪器能正确显示操作者的设定方式 正确运作仪器精确
9、度指该实验仪器每次操作都能显示相同的检测结果 可重复性,影响HER2检测结果之因素：检测中,实验室步骤须经验证之免疫组化实验步骤,实验室步骤,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,影响HER2检测结果之因素：检测中,检测人员相关检测人员应接受正规检测技术培训（包括资格考试）并给予相应支持定期考评：例如年度考评,检测人员,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145;乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂志 2009,38(12):836-840,影响H
10、ER2检测结果之因素：检测中,抗原修复类型所采用之抗原修复系统与现有实验条件相适应，并能产生可重复性结果,抗原修复类型,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,相同FISH阴性乳腺癌组织标本应用相同浓度抗HER2 抗体检测结果,合理抗原修复,抗原修复对免疫组化检测结果很重要,图片由 A Morey,St Vincents Hospital,NSW,Australia提供.,影响HER2检测结果之因素：检测中,检测试剂所有试剂应确保其质量稳定，经对照组实验验证后可使用所有验证应当记录，签名和登记日期,检测试剂,Wolff AC,et al.J Cl
11、in Oncol 2007;25:118145.,影响HER2检测结果之因素：检测中,对照对照组与实验组实验过程应一致应使用已知实验结果的组织作为对照可用已经验证的对照检测新抗体活性用于对照的组织标本可自行制备或购买而得,对照,阳性及阴性对照,组织标本阳性对照组理想之阳性对照组,HER2阳性(IHC3+)1,W Hanna供图;2.L Bornstein供图.,MDAMB175,HER2阴性(IHC1+)2,对照细胞系之准备SK-BR-3,HER2阳性(IHC3+)1,内部对照设置,患者标本中肿瘤未累及部分可作为内部阴性对照组；若阴性对照结果亦出现染色，则原肿瘤标本之染色结果无效对照监控如若对
12、照组未显示预期结果，则实验应重做,例如，正常乳腺上皮膜染色 重复免疫组化检测,W Hanna供图.,影响HER2检测结果之因素：检测中,检测实验条件检测应于适当条件下进行温度及湿度的变化会影响染色结果检测条件需确保得到可靠且可重复的HER2检测结果,检测条件,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,如何达到高质量免疫组化检测,勿让低年资实验室技术人员配置试剂若试剂未能正确配制，免疫组化结果将不可靠低年资技术人员应接收试剂配制训练及上级指导监督正确的抗体稀释可避免免疫组化的误差记录每次抗体稀释的浓度，每次登记相应日期及时间如遇错误检测结果，上述记录
13、数据可用来追溯错误原因完善改进抗原修复方法较耗时但必须进行,设计验证步骤,目的确定经证实或验证之相关实验步骤是否可于本实验室可行确定检测参数固定检测方法及条件试剂及浓度操作设定(若自动化操作)操作人员技术能力样本(检测组)选择25100个样本用不同经证实的检测方式进行检测，可使用组织芯片,请注意:乳腺癌与胃癌标本进行检测验证应分开进行,设计验证步骤,记录实验验证的每一操作步骤这些记录可用于建立实验室标准化操作参考指南记录所有操作步骤若任何一个步骤发生变化，整个实验必须重做目标：阳性及阴性实验验证组与原实验结果达95%的一致性,使用自动化平台有助HER2检测标准化,如果使用自动化检测，必须基于现
14、有的经验证的手动操作方案,PQCC委员会提供数据,国家质量控制认证项目中自动与手动HER2检测方法对比,HER2检测的影响因素：检测后,35,影响HER2检测结果之因素：检测后,图像分析方法,判读标准,报告内容,评分系统,HER2检测偏倚,检测后,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,影响HER2检测结果之因素：检测后,检测结果判读标准及评分系统需依国内/国际HER2检测指南进行标准化操作,判读标准,评分系统,图像分析方法,IHC检测结果判读及评分,多数操作指南推荐下列分析免疫组化检测结果的标准：依细胞染色百分比及强度进行评分:乳腺癌:全膜染色
15、评估染色侵入部分，但不包括原位部分寻找完整深染色及均匀的全膜区域胃癌：基底侧膜、侧膜或完全性膜染色分析检测结果时，细胞质染色应排除在外。若细胞质染色干扰细胞膜染色结果判断时，应重新检测。正常上皮细胞不应有染色出现。若出现染色，则应重新检测。留意待检标本出现收缩/破损,这些现象会造成检测结果的假阳性若标本染色不均，应依染色最强部位进行评分根据对照组实验结果决定实验组检测结果是否可信乳腺癌或胃癌检测应使用其特异性评分标准,Wolff AC et al.J Clin Oncol 2007;25:118145;.,ISH检测结果判读及评分,所有乳腺癌及胃癌IHC2+标本均需再次进行ISH检测进行确定分
16、析ISH检测结果时之注意事项：乳腺癌：依H 原位癌不予评分从浸润性肿瘤的两个不同区域数细胞胃癌：由于HER2的表达异质性，必需筛选出整个扩增区域包括来自于不同肿瘤领域的细胞以提供一个更加统一的分析评分标准Brightfield方法如SISH建议确认HER2扩增重点区域依对照组检测结果决定实验组检测结果是否可信于两个肿瘤侵及区域计数至少20个不重叠的细胞若信号不均匀(25%)，应重新检测若检测结果自发荧光过强或核清晰度较差时则应重新检测若背景干扰信号辨识时，应重新检测(10%细胞质信号)重复信号作单一计数,Wolff AC et al.J Clin Oncol 2007;25:118145;.,
17、影响HER2检测结果之因素：检测后,检测报告检测报告应包含以下信息：标本部位及类型固定液种类标本离体至固定时间标本固定的时间抗体检测方法图像分析方法对照设置,报告内容,乳腺癌HER2检测指南（2009版）编写组 乳腺癌HER2检测指南（2009版）中华病理学杂2009;38(12):836840.,HER2检测的质量保证,理想的质量体系包括,内部质保计划外部质保计划参与Ring研究,内部质保,43,内部质保理想计划,继续进行质控及检测仪器维护继续进行实验室人员技术训练及能力测评实验步骤严格遵守标准化操作方案常规对照组(阳性，阴性及内部对照组)；任何对照组若出现非预期实验结果，则应重新检测将检测
18、阳性率及阴性率与已发表数据比较，从而监控检测质量对病理医生进行继续教育及能力测评(如进行同行检测能力比较)继续进行常规评价及总结，分析现存问题，及时弥补不足,外部质保,45,外部质保内容,美国病理学会（CAP）认证内容要求检查时记录验证检测之方法检测步骤之使用检测技术人员之培训标本及试剂之正确标记标本及试剂之正确贮存检测仪器之校准及质控内部质保计划及实施依据检测质量检测技术人员及病理医生检测能力之测评检测报告之准确性及质量正确提交检测结果,Wolff AC,et al.J Clin Oncol 2007;25:118145.,参与外部质保之益处,可证明本实验室HER2检测结果是否准确可验证本实
19、验室检测方法检测操作较差之实验室可得到较多相关建议及帮助本实验室检测技术及检测结果判读的困难可得到及时纠正及弥补,美国病理医师学会（CAP）认证（乳腺癌）,CAP 提供HER2检测认证熟练检测(按照ASCO*/CAP HER2 检测指南和认证列表)质量管理/QC结果报告具有IHC或ISH进行HER2检测条件的CAP认证实验室需要注册并参与CAP认可的熟练性测试实验室表现将被监测；实验室必须达到90%或以上的测试评分（如果每次测试都能成功提交的话）发送HER2切片到其他设备进行组织处理和染色、并将结果拿回进行判读的实验室，必须参与熟练性测试,Accessed 14 December 2010.,
20、*ASCO,美国临床肿瘤医师协会,英国国家外部质量保证评价计划（乳腺癌）,向全球实验室开放计划针对免疫组化及原位杂交检测参与该计划的实验室每季度需对该计划组织所提供的细胞系标本进行免疫组化检测，检测结果将交回该计划组织送回该计划组织之检测结果将由四位专家进行最终评分，取平均分作为参与实验室最后得分最终评分结果有利于相关实验室改进现有实验操作技术以及接受相关技术培训,Accessed 14 December 2010.,Ring研究,50,什么是Ring研究？,Ring研究是指几个不同的检测中心对同样的组织样本进行评估。评估分几轮进行，在每一轮评估中，每个检测中心轮流提供组织样本。然后对不同检测
21、中心的检测结果进行比较，从而评价每个检测中心的检测水平,Ring研究确保HER2检测持续准确：胃癌检测之经验,德国、法国及其他国家已经发表了Ring研究的相关内容初步研究数据显示：只要严格遵守检测步骤，不同病理医生HER2检测结果可达一致检测胃癌HER2状态的病理医生需经特别培训，并遵守胃癌检测特异性操作指南,Rschoff J,et al.Virchows Archiv 2010;457:299307.,Ring研究应确定病理医生每次HER2检测结果及评分是否一致,实验室间差异预选代表所有肿瘤类型的待检标本依检测试剂盒生产商标准操作步骤进行检测检测员间差异经染色的已知HER2表达水平的肿瘤检测标本检测标本由不同病理医生独立评估HER2评分差异并不由不同实验室间染色结果差异而决定,Ring研究流程图示例,选择胃癌组织芯片样本,依检测试剂盒生产商标准操作步骤检测HER2(免疫组化或原位杂交),确定与胃癌免疫组化检测评分相关问题,不同实验室间差异,选择经免疫组化染色的系列组织芯片样品,不同病理医生独立检测(强度及检测区域评分),检测员间差异,请注意：组织芯片并不适用于治疗相关的诊断；然而可用于质控、质保评价,.,总结,尽量降低HER2检测之偏倚率检测前检测中检测后标准化操作培训及教育监控及检测复评与其他实验室比较检测结果如有需要应采取补救措施持续性、常规性及不断的评估,
