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1、IPTG诱导的蛋白表达调控,1.课题来源：,实验步骤：接种 扩大培养 IPTG诱导 蛋白提取、纯化思考：IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用原理？,2.IPTG的作用原理,IPTG(isopropylthiog-alactoside,异丙基硫代半乳糖苷):化学合成的乳糖类似物，很强的 半乳糖苷酶诱导剂，诱导乳糖操纵元(lac operon)的开放，自身不被催化分解。类似的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。,2.IP
2、TG的作用原理,2.1 乳糖操纵元（lac operon）,大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactose permease)和催化乳糖分解第一步的 半乳糖苷酶(-galactosidase)。在环境中没有乳糖或其他-半乳糖苷时，大肠杆菌合成-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖或其类似物2-3分钟后，细菌大量合成-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。,2.1 乳糖操纵元（lac operon）,乳糖操纵元含有、和3个结构基因。基因表达产物为-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，
3、再分解为半乳糖和葡萄糖；基因编码半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；基因编码转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。,2.1 乳糖操纵元（lac operon）,2.1 乳糖操纵元（lac operon）,基因5侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosome binding site，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。,由于、三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白
4、质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。,2.1 乳糖操纵元（lac operon）,2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控,操纵子（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。在乳糖操纵元中，调控基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R。,2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控,2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控,当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，lac操纵元
5、处于阻遏状态。此基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子Plac的结合，阻止了基因的转录起动，从而阻遏了这群基因的表达。,2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控,2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控,当环境中有足够的乳糖时，乳糖受-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类，半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍
6、。这就是乳糖对lac操纵元的诱导作用。,2.2 乳糖操纵元（lac operon）的负调控,在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放,2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控,细菌中的cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解产生能量时，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就升高。,2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控,细菌中有一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP（cAMP receptor prote
7、in），当CRP未与cAMP结合时它是没有活性的，当cAMP浓度升高时，CRP与cAMP结合并发生空间构象的变化而活化，称为CAP（CRP-cAMP activated protein），能以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。,2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控,2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控,在lac操纵元的启动子Plac上游端有一段序列与Plac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点（CAP binding site）。CAP与这段序列结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍。相反，当有葡萄糖可供分解利用时，cAMP浓度降
8、低，CRP不能被活化，lac操纵元的结构基因表达下降。,2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控,由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖。,2.3 乳糖操纵元（lac operon）的正调控,不难看出：CAP结合位点就是一种起正性调控作用的操纵子，CAP则是对转录起正性作用的调控蛋白激活蛋白，编码CRP的基因也
9、是一个调控基因，不过它并不在lac操纵元的附近，CAP可以对几个操纵元都起作用。从上所述，乳糖操纵元属于可诱导操纵元（inducible operon），这类操纵元通常是关闭的，当受效应物作用后诱导开放转录。这类操纵元使细菌能适应环境的变化，最有效地利用环境能提供的能源底物。,3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用,运用乳糖操纵元控制外源蛋白表达的目的：在需要菌体大量繁殖时，为了提供更多的物质和能量确保菌体正常快速的生长，需要将外源基因关闭。菌体浓度达到要求时，可通过诱导使菌体表达大量外源蛋白。,3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用,在我们所使用的PGEX载体中，插入了乳糖操纵元的调控基因lac
10、 Iq和启动子Plac，其后紧接GST基因、外源基因。这些基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。,vector information,MCS region,3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用,3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用,IPTG诱导的表达载体必须以过表达lac阻遏物的大肠杆菌为宿主，才能阻止外源基因在诱导前的转录。由于大多数IPTG诱导的表达质粒拷贝数很高（30600），因此需要过量阻遏物才能阻断基础表达（渗漏表达）。单拷贝的lac Iq等位基因可以表达过量10倍的lac阻遏物但是，如果外源蛋白对宿主的毒性非常强，或者质粒拷贝数非常高，就需要将lac Iq等位基因克隆进表达质粒，确保紧密调节。,3 乳糖操纵元在外源蛋白表达中的应用,IPTG诱导的条件：一般：0.5mM 28 3.5hours 通过调节温度和IPTG的浓度，诱导表达质粒慢转导，防止外源蛋白表达过快而形成包涵体。影响大肠杆菌中获得高表达水平的重要因素可能是生长温度，通过实验确定最佳温度，是表达外源蛋白的关键。表达量低 高温诱导 易形成包涵体 低温诱导,
