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1、实时荧光定量PCR实验原理与技术,胡晓研究生实验技术2015-12-7,qRT-PCR技术原理,一、实验原理：在 PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光信号+标准曲线,定量分析？,qRT-PCR技术原理,Ct值(Cycle Threshold;每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关系。以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知样本的初始拷贝数。（定量分析）,qRT-PCR技术荧光标记方法的分类,非特异性的DNA结合染料法：荧光
2、染料能非特异结合DNA 双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。常用染料：Pico Green（灵敏度高,=25pg/mL）SYBR I 缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。,qRT-PCR技术荧光标记方法的分类,qRT-PCR技术荧光标记方法的分类,2.特异性荧光定量PCR:以荧光共振能量转移原理为基础水解探针法分子信标Scorpion引物/探针复合探针,qRT-PCR技术影响因素,样品RNA 的完整性RNA 样品中的基因组 DNA污染特异性良好的引物PCR反应体系的优化反转录所得 cDNA 的量必须精确地等于相应的mRNA的量可靠的内
3、标基因：TEF-2,qRT-PCR技术实验操作,qRT-PCR技术实验操作,阳性模板,qRT-PCR技术实验操作,制作标准品阳性对照：测定阳性模板的浓度，10倍稀释为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体系如下:(标准品反应体系)序号 反应物 剂量 SYBR Green 1 染料 10l 阳性模板上游引物F 0.5l 阳性模板下游引物R 0.5l dNTP 0.5l Taq酶 1l阳性模板DNA 5l ddH2O 32.5l 总体积 50l3.轻弹管底将溶液混合，短暂离心。,(内参照基因反应体系)序号 反应物 剂量 SYBR Green 1 染料 1
4、0l 内参照上游引物F 0.5l 内参照下游引物R 0.5l dNTP 0.5l Taq酶 1l 待测样品cDNA 5l ddH2O 32.5l 总体积 50l,qRT-PCR技术实验操作,1、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板：针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。序号 反应物 剂量 1 10 PCR缓冲液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul ddH2O 至25ul,轻弹管底将溶液混合，6000rp
5、m短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）;72C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。,qRT-PCR技术实验操作,待测样品的待测基因实时定量PCR:所有cDNA样品分别配臵实时定量 PCR反应体系。体系配臵如下：序号 反应物 剂量SYBR Green 1 染料 10 ul上游引物 1ul 下游引物 1ul dNTP 1ul
6、 Taq聚合酶 2ul 待测样品cDNA 5ul ddH2O 30ul 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。,qRT-PCR技术实验操作,上机前样本的制备,检测程序的设置,检测孔及相关参数的设置,热循环参数的设置,运行检测程序,结果的显示与输出,结果分析,熔解曲线,扩增曲线,qRT-PCR技术实验操作,qRT-PCR技术实验操作（优化）,qRT-PCR技术实验操作（优化）,qRT-PCR技术实验操作（优化）,假阳性：荧光染料能和任何 ds DNA 结合，因此它也能与非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利用
7、热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲线分析。,熔解曲线峰为单一峰形，未见其他峰值，并且峰的形状也比较锐利。扩增产物特异性好。,qRT-PCR技术实验操作（优化）,有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度大于引物二聚体的退火温度 Tm，而小于特异性扩增产物的 Tm值。在此温度下，引物二聚体都变性成单链，因此只检测到与特异性 PCR 产物结合的 SYBR Green I 所发出的荧光，消除了引物二聚体的干扰，降低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。,qRT-PCR技术实验操作（优化）,标准品的选择：理论上可以以目的基因的P
8、CR扩增产物为标准品，但是存在降解、污染等因素影响定量结果。论坛网友给出了几种解决方法：另设计一对引物用于荧光PCR；将扩增序列插入T载体后作为标准品；设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体(+),qRT-PCR技术实验操作（优化）,半定量PCR,1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差,半定量PCR实验过程,总RNA提取；模板cDNA制作；半定量PT-PCR：,半定量PCR优化步骤,引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的一个外显子的5端和下一个外显子的3端。b)设计在两个离得远的外显子上。引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或G；GC含量为40-60之间。如此，管家基因与目的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为350bp-600bp之间内参的选择同管扩增或异管扩增的选择PCR循环数的选择,
