第二章种子扩大培养ppt课件.ppt

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1、第二章,第五节 种子扩大培养,定义：菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。,种子必须具备的条件,菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐 中能迅速生长生理性状稳定菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要 求无杂菌污染（不带杂菌）生产能力稳定,几个概念,种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。发酵级数：种子罐的级数加一。接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。种龄：生产种子的培养时间。,微生物的扩大培养,现代的发酵工业生

2、产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。,菌种扩大培养的目的：就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。,种子扩大培养的任务：不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。,种子扩大培养的过程：斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐,因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。,对于不同产品的发酵过程来说，必

3、须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。,一、种子扩大培养流程图,实验室种子制备阶段（一级种子培养）,生产车间种子制备阶段（二级种子培养、三级种子培养）二级发酵 三级发酵,砂土孢子,冷冻干燥孢子,斜面孢子,摇瓶液体培养,茄子瓶斜面培养,固体培养基培养,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量少，故种子罐数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种子罐后于32培养7-10h，菌浓达到108-109个/ml，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培

4、养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐27 培养40h后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于27 培养10-24h移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,（一）实验室种子的制备两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程 在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。,产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种：采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。,1孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要

5、环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响，不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。,(1)放线菌孢子的制备,琼脂斜面培养基：适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等；碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1，氮源不超过0.5)。碳源丰富：生理酸性环境，不利于放线菌孢子的形成；氮源丰富：有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28，少数为37，培养时间为514天。,用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异，子斜面孢子接入液体培养基可节约菌

6、种用量。菌种进入种子罐有两种方法：孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间,(2)霉菌孢子的制备 培养基：天然农产品如大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等；营养成分较适合霉菌的孢子繁殖；培养基表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为2528，培养时间为414天。(3)细菌培养物的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。培养温度：多

7、数为37，少数为28。培养时间：12天，产芽孢的细菌则需培养5一10天。,实验室种子的制备：e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)原始菌种 斜面试管 获得孢子 250ml 茄子瓶（大米或小米）25 28，414天 成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 冰箱保存）。,(4)斜面种子的制备,斜面种子：在试管或扁瓶内，琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。制备流程：略 制备过程注意事项：A琼脂要完全浸没在营养液内，用量1.0%-2.5%B 营养液中最好不含易沉淀的固形物；C 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3；D 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水；F

8、 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入。,影响斜面种子质量的因素(1)原材料质量，水质，培养基pH(2)灭菌条件(3)接种量(4)培养室温度、湿度、通风(5)培养时间(6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯）(7)冷藏条件,2.液体种子制备,（1）好氧培养如链霉菌等，其过程如下：试管三角瓶摇床种子罐（2）厌氧培养对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：试管三角瓶卡式罐种子罐,e.g.对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色

9、链霉菌（Sgriseus），产卡那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。,e.g.Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）固体试管斜面（32 C，1824小时）三角瓶培养（摇床）(flask culture)种子罐培养 e.g.yeast：原始菌种（出发菌种）10ml

10、麦汁试管 250ml 三角瓶培养（25 C 27C，3天）（25C，2天）510 L卡氏罐（15 C 20 C，35天）,种子制备 将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。,（二）生产车间种子制备,实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,1.摇瓶种子制备,孢子发芽和菌丝繁殖速度

11、缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶相当于微缩了的种子罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基：丰富、完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶菌种进罐法。,2.种子罐种子制备,可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接

12、入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子；把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。,种子制备的目的：形成一定数量和质量的菌体。孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐内即可进行。发酵的目的：获得大量的发酵产物。产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。若干发酵产物的产生菌，其不同生长阶段对营养差异。因此，将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在

13、一个大罐内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。,种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。,种子罐级数的确定：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。比如：细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27,40小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（27，10-24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子,3，确定种子罐级数需注意的问题,（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会（2

14、）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,种子罐级数需考虑：尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率产物mlh。e.g.Glutamate Glutamate fermentation 一级种子扩培 实验室种子 种子罐 发酵罐 e.g.penicillin fermentation 二级种子扩培 实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐 e.g.Strept

15、omycin fermentation 三级种子扩培实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 三级种子罐 发酵罐(Streptomyces griseus)灰色链霉菌,三、种子培养工业微生物培养的类型,静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养(anaerobic culturing),通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性 培养(aerobic culturing)。,种子扩大培养的方法：1 表面培养法（surface culturing)：好氧静置培养法。针对

16、容器内培养基物形态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。,2 固体培养（发酵）法(solid culturing)：固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。,3 液体深层培养（发酵）法：(liquid submerged culturing)液体深层发酵法从罐底部通气，进入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐的底部通气

17、搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。液体曲(liquid koji)、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinic acid)及其他发酵产品先后采用此法进行生产。特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。,外循环气升式发酵罐 内循环气升式发酵罐,小型机械搅拌发酵罐1三角皮带转轴；2轴承支架；3联轴节；4轴封；5窥镜；6取样口；7冷却水出口；8夹套；9螺旋片；10温度计接口；11轴；12搅拌器；13底轴承；14放料口；15冷水进口；16通风管；17热电偶接口；18挡板；19接

18、压力表；20手孔；21电动机；22排气口；23取样口；24进料口；25压力表接口；26窥镜；27手孔；28补料口,深层培养的几个主要控制点A 灭菌(sterilization)：发酵工业要求纯培养。因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。B 温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行培养，由于随着微生物的生长和繁殖，会有热量产生、搅拌产热等，所以要维持温度恒定。C 通气(aeration)、搅拌(agitation)：空气进入发酵罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。搅拌的目的：增加溶解氧；使基质混合均匀；促进热传递。（培养液中的微生物

19、均匀地分散在种子罐内，并使加入的酸和碱均匀分散等）。,4.载体培养法 以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可严格控制，可反复使用。要求：耐蒸汽加热或药物灭菌,四、种子质量控制（一）影响孢子质量的因素及控制1、培养基2、培养温度和湿度3、培养时间和冷藏时间4、接种量,1.培养基,培养基原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮（wheat bran）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素Mg2+、Ca 2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多

20、或太少也会影响孢子的质量。水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,解决措施,斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用；严格控制灭菌后的培养基质量；斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定的时间，使斜面无冷凝水呈现，水分适中有利于孢子生长。配制孢子培养基还应该考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择。,在制备固体培养基时有两条经验：供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正

21、常菌落类型的优势；作为选种或分离用的平板培养基，则需采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。,2.培养温度和湿度,要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素生产菌种龟裂霉菌的孢子，在北方干燥地区孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培养基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少，相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。在一定条件下培养斜面孢子时，在北方相对湿度控制在4045，在南方相对湿度控制在35一42，所得孢子质量较好。,一

22、般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高墙养箱内的相对湿度。为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长，现代化的培养箱恒温、恒湿，并可换气，不用人工控制 最适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培养基组分不同，对微 生物的最适温度会有影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微生物培养的最适相对湿度。,3.培养时间和冷藏时间,孢子的培养工艺一般选择在孢子成熟阶段时终止培养，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子。孢子过于年轻经不起冷藏；过于衰老会导致生产能力下降；孢子培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发

23、酵产量正常的阶段终止培养。冷藏时间：宜短不宜长。如土霉素菌种孢子斜面培养4天左右，即于4冰箱保存，发现冷藏7-8天菌体自溶，而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素生产菌，斜面孢子在6 冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。,4.接种量,接种量的大小影响到一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响菌体的生长状态。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种。传代用斜面孢子：菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代。接种摇瓶或进罐用：要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求。3cm*20cm试管斜面，丝状菌孢子107。接入种子罐的孢子接种量对发酵生产影响（如青霉素）：过少，进罐

24、后长出的球状体过大，影响通气；过多，进罐后不能维持很好的球状体,获得高质量孢子，需对菌种质量加以控制，定期分离复壮。制备好的斜面孢子，经摇瓶发酵试验合格后用于发酵生产。种子质量受孢子质量、培养基、培养条件、种龄、接种量等因素影响。摇瓶种子质量以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度及糖氮代谢、pH变化等为制备，符合要求方可进罐。,（二）影响种子质量的因素 1.培养基原材料质量：种子培养基原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同。P含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），

25、也对种子质量多少有些影响。,种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择有利孢子发芽和菌丝生长的培养基，营养成分丰富完全，使菌丝粗壮并具有较强活力。一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。种子培养基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。pH变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。,2.培养条件：,（1）选择最适温度（2）通气搅拌：各级种子罐或同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，区别控制。前期需氧少；后期需氧多

26、。Eg:青霉素种子制备，通气量充足可提高种子质量。土霉素发酵，一级种子罐通气量少有利发酵。（3）补料工艺：种子罐培养一定时间，补入一定量种子培养液,3.种龄种龄(seed age)指种子罐中培养的种子开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。过老：生产能力下降，菌体自溶。过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。嗜碱性芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)生产碱性蛋白酶（alkaline proteinase/protease），培养12小时接种，酶活最高

27、。,4.接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。Antibiotic：7%7.5%Glu：1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液黏度增加，溶氧降低，产物合成受影响。e.g.嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶：接种1%，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。,制霉菌素生产中，1%比10%效果好，0.1%与1%效果

28、相当。发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。如谷氨酸：大接种量20%，高生物素，高青霉素的强制发酵工艺。有的采用双种法增大接种量：两只种子罐 一只发酵罐 如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（fermentation titer unit）提高8%，到达产量 高 峰的 时间提前。倒种法：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。如 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。通常接种量，细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%,四.种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力 必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，

29、保证无杂菌侵入 1.菌种稳定性的检查：少量菌种无菌生理盐水递增稀释平板划线培养。挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。2.无菌检查：显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。,五.种子质量的判断：考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。感官判断：看颜色、闻气味 理化指标测定：1、pH值 2、培养基灭菌后的糖、氨基氮 3、菌体形态、浓度 4、产物量 5、残糖浓度 6、酶活力（如土霉素生产，淀粉酶的活力与发酵单位有一定的关系）。,六 种子质量标准,不同产品、不同菌种以及不同工艺条件的种子质量有所不同。判

30、断种子质量的优劣需要有丰富的实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准：(1)细胞或菌体种子培养的目的：获得健壮和足够数量的菌体。种子质量的重要指标：菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。菌体形态可通过显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。,(2)生化指标 种子液的糖、氮、磷含量的变化和p

31、H值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况且变化为指标的。(3)产物生成量 种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。(4)酶活力 测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。如：土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为判断该种子质量的依据。此外，种子应确保无任何杂菌污染。,6种子异常的分析,在生产过程中，种子质量受各种各样因素的影响，种子异常的情况时有发生，会给发酵带来很大的困难。种子异常往往表现为菌种生

32、长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。(1)菌种生长发育缓慢或过快 此种现象的出现与孢子质量以及种子罐的培养条件有关。生产中，通入种子罐的无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。生产中，培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量。,(2)菌丝结团,在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。这时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收。如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显着影响。如果菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，

33、影响发酵正常进行。菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关，一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。,(3)菌丝粘壁,菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘在罐壁上。其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团。以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。,思考题P49,常用的 六大微生物有哪些？菌种衰退的原因是什么？原生质体融合的步骤有哪些？改良菌种的方法有哪些？什么是工程菌？常用的三大微生物的接种量范围是怎样的？,章节重点,工业生产常用的微生物种类引起工业用菌衰退的原因工业微生物菌种的选育

34、方法诱变育种的操作过程及筛选方法菌种改良的方法如何进行微生物细胞融合改良菌种基因工程育种的过程种子的扩大培养,种子罐的级数越多好还是越少好？,种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐最终代谢产物积累的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。,问题1,问题2,什么叫接种龄？以什么接种龄接种较好？,指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常接种龄以菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。对于年轻的种子接入发酵罐后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长；过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。,问题3,什么叫接种量？以什么接种量接种较好？,指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。如大多数抗生素发酵的最适接种量为7%-15%，由棒状杆菌进行谷氨酸发酵的接种量只需用1%。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物的合成。,