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1、PCR和DNA测序技术,Polymerase Chain Reaction(PCR，多聚酶链式反应)特异片断的体外扩增技术无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique）,常用PCR仪,1993年至今：计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程序，使之迅速得到推广。PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑，巨大的推动作用。,发展历程,1983年，由Cetus 公司的Kary Mullis 建立,1985年，Saiki等在science上详细描述（人珠蛋白DNA）,1988年 耐热的Taq DNA聚合酶被发现和应用，把 P
2、CR推向了实用 阶段，成为PCR发展史上又一里程碑,1989年，美国专利局授予PCR技术专利；PCR技术被science杂志评选为伟大的技术发明；1989年为DNA聚合酶的分http:/子年,1993年，Mullis 获得诺贝尔化学奖。,类似DNA在细胞内的复制过程:由一对引物介导,通过温度调节，使双链DNA变成单链（变性）；单链DNA能与引物复性（退火）成为 引物-DNA单链复合物；在dNTPs存在下，DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（延伸）PCR循环：一个热变性-复性-延伸的过程。通常，20-30个循环之后，可获得大约106倍待扩增的DNA片段的拷贝。,什么是PCR?,DN
3、A在细胞内的复制过程a,DNA在细胞内的复制过程b,DNA复制过程中,2条新生链都只能从5端向3端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成.,DNA在细胞内的复制过程c,DNA在细胞内的复制过程d,DNA在细胞内的复制过程e,1.PCR的基本原理,在离心管中进行的DNA合成扩增技术，模拟染色体的体内复制过程；,与体内DNA复制的不同之处：耐热的Taq酶取代普通的DNA聚合酶 用合成的DNA引物替代DNA引物 温度的调节：变性、退火、延伸 反复循环，可使DNA无限扩增,PCR的第1个循环过程,PCR的第1和2个循环过程,PCR,PCR的第3个循环过程,PCR技术的使用,PCR的标准反应程序：变性-复
4、性-延伸,1)DNA模板的解链（变性）90 95，30s 理论上，在90左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存,2)DNA 单链与引物的退火（复性）55 65，3045s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率DNA自身复性 几率）;引物的最佳退火温度Tm-5，引物的量 引物的长度,3)引物的延伸（新链DNA的合成）7075，3060s（2kb)首次循环：引物从3端开始延伸，延伸片段的5端为人工合成引物是特定的，3端没有固定的终止点，长
5、短不一第二个循环：引物与新链结合，由于后者5端序列是固定的末端，意味着5端的序列就成为此次延伸片段3端的终止点N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5端的限定，产物的序列是介于两种引物5端之间的区域引物本身也是新生DNA链的一部分(10kb-15min),4)循环次数的设定 主要取决于最初靶分子的浓度如：3x105、1.5x104、1x103、50 copy 2530、3035、3540、4045cycle 过多的循环次数会增加非特异性扩增和碱基错配数；平台效应：PCR反应后期，扩增产物并不成指数方式的增加；产生原因：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，酶活力降低，产物浓度增高后
6、变性不完全而影响引物延伸,2.标准体系：常选用20100ul体系 模板核酸（template如：人基因组DNA 0.1ug)扩增引物（primer一对,各0.25umol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP（四种：各200umol/L)标准缓冲液：10X buffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或明胶）无菌双蒸水或三蒸水 石蜡油或矿物油:30-50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）,3.影响PCR反应的因素(最适条件）,(1)模板：将要被复制的核酸片段 DNA或RNA（RNAcDNA）,较高的纯度：最好用纯化的DNA样品，（避免混有蛋白酶、核酸酶）。用量合适：1021
7、05分子数（100ng）（提高产量，减少非特异性扩增）；线性DNA分子：环状DNA复性太快,以RNA（cDNA）为模板：（逆转录PCR）,变性温度及时间：94，30s 过长：酶活性降低 过短：解链不完全,a.引物的作用：定位、定向、定范围，引物决定PCR扩增产物的特异性与长度，引物设计决定PCR反应的成败。,5)一对引物间不应互补（连续互补少于4bp)，尤其是它们的3端不应互补。,(2)引物（寡核苷酸引物）,1)长度 16-30bp，一对引物。过短非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增，从而降低扩增的灵敏性；过长易形成稳定的杂合体或链内互补，使引物的延伸温度超过Taq酶的最适 温度，同时还使检测
8、成本增加。,2)G+C含量：占40-60%，Tm值在55 以上。,b.引物的设计原则,3)碱基的随机分布：不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在。,4)引物自身不存在互补碱基（连续互补少于3bp)，防止二聚体产生,9)引物的5端可以修饰：包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。,7)引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或有连续8个 互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。,6)引物的纯度要高。,8)引物的3端一定要与模板配对（特异性，引发延伸的点），以引物3端A影响最大；末端最佳选择为G 和C；引物3端不要是编码密码子的第3个碱基，密码子
9、的简并性会影响扩增特异性,c.引物的浓度：；引物：模板=108：1。过低：将导致扩增效率下降；过高：导致异位引导而使扩增的特异性下降。对称PCR：二个引物的浓度相等；不对称PCR：二个引物的浓度为50:1或100:1,d.引物的退火温度:（决定产物的特异性）引物本身的实际变性温度-5(25),55开始。,e.引物的延伸温度与时间 温度：68-72，温度主要取决于所用DNA聚合酶的最适温度。时间：30-60s，决定于靶序列的长度，以及延伸温度。72时的核苷酸掺入率：30-100bp/s，即1min：2kb。,(3)DNA聚合酶,a.大肠杆菌聚合酶的Klenow片断：不耐热，每次循环需重加酶。,c
10、.其他聚合酶,b.Taq酶（1988年）：是从温泉耐高温细菌中提取的耐热性DNA聚合酶，其活性需要Mg2+。但Taq-DNA聚合酶有一定错配率（无35外切酶活性，有53外切酶活性），为0.1%-0.25%（30次cycle）；若要细胞克隆PCR扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用,Characteristics of Taq Polymerase,Tth、Pfu、Vent聚合酶：具有校读功能。因为具有3-5外切酶活性，高保真扩增。活力要比Taq酶低。,总结,PCR 技术要点：,1、反应体系的优化,常用的PCR技术,热启动PCRTD-PCR(touch down PCR,TD-PCR
11、)巢式PCR反向PCR锚定PCR荧光定量PCRRT-PCR不对称PCR,1、热启动PCR,热启动PCR（hot start PCR）是一种改良的PCR方法，可有效避免非特异性扩增。将DNA聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，避免在未达到设定温度前就开始反应。,热启动PCR有几种方式：,蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反应物加入PCR管后，加滴熔融的石蜡；待石蜡凝固后再加入聚合酶。放入PCR仪开始反应升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反应物混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。热启动聚合酶（化学型）：经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动。热启动聚合酶（抗体）：带
12、有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动。热启动聚合酶（共价键结）：改良自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离。,2、TD-PCR,即touchdown PCR，降落PCR。指每一个（或n个）循环降低1（或n）退火温度，直至达到一个较低的退火温度（touchdown退火温度）。然后以此温度进行10个循环。正确和非正确退火温度1差异将造成PCR产物量4倍的差异，如果相差5，就会产生4的五次方（1024）倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的Tm值15左右，再接下来的循环中，退火温度以每次1-2逐渐降低，直到Tm值以下5，当达到
13、特异的引物-模板结合的Tm值时，扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。此法扩增可利于PCR产物纯化。,TD-PCR注意事项,由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TDPCR中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越15左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10。,3、巢式PCR Nested PCR,利用两套PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。,4、反向PCR,PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，而反向PCR则可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。,方法：先用限
14、制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；,反向PCR可用于 研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列（染色体缓移或染色体步移）。,反向PCR方法的不足,需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，因此，反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。,5、锚定PCR,锚地PCR技术是 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端
15、加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。,6、RT-PCR,反转录RCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）实时荧光定量PCR（real time PCR,RT-PCR）,7、RACE技术,RACE：快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification cDNA End)技术，获得全长cDNA的快速有效的方法。RACE法就是通过向cDNA末端加尾，根据已知序列和加尾 设计引物扩增 获取cDNA末端未知序列的方法。5 RACE 和 3RACE的原理不一样,Takara公司3 RACE和 5 RACE 试剂盒原理,3RA
16、CE的局限性及注意事项,3末端RACE相对容易，因为存在一个poly(A)，而且降解往往也不是从3末端开始的。局限性：细菌和一些病毒的基因组的3末端通常没有poly（A），这个方法就不适用；而且在有一些RNA中，这个poly(A)也容易丢失 解决办法：可以通过poly(A)聚合酶在末端加A即可RNA中加入RNA酶抑制剂，很有利于保持完整的RNA,5RACE的局限性,通常，提取的RNA都会有些降解，而RNA的降解是从5端开始的，所以用5末端磷酸化的RT-primer去拉的时候，5末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几Kb以上的，就更不能保证该引物能将5末端拉全。,Takara公司的5RAC
17、E新方法,对5race做一点说明,这个方法其实存在着很大的局限。因为我们平时提RNA时，一般多少都有些降解，而RNA的降解是从5端开始的，所以你用5末端磷酸化的RTprimer去拉的时候，5末端往往不全，而且随着RNA链的增长，比如几Kb以上的，就更不能保证该prime能将5末端拉全。,8、SMART技术全长cDNA文库的构建技术Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript(SMART),前提：真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程：1、mRNA的3末端都带有一段Poly A（利用逆转录酶制备cDNA文库的基础）2、
18、mRNA的5末端是真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G。,SMART技术的原理,在合成cDNA的反应体系中，事先加入一条3末端带Oligo（dG）的SMART引物；在逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链阶段，序列延伸到mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的第一链cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板（此时，含有Oligo（dG）的SMART引物成为模板）,逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所
19、有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。,SMART技术的特点,主要用途：直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE）用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。,利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，单管内一步完成，无需额外的cDNA抽提纯化或沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，得到的cDNA能够代表原有样
20、品中的mRNA的丰度,9、不对称PCR,在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前10-12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序,10、实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR）,普通PCR技术的定性和定量分析：定性：凝胶电泳的方法 定量：通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描进行分析 对象：PCR扩增的终产物,普通PCR技术的局限性：无法获得某一转基因动、植物转基因的拷贝数 或者 某一特定基因
21、在特定组织中的表达量,Real-time Q-PCR,简言之，利用荧光信号检测整个PCR扩增过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线,特点：可以对DNA模板进行定量分析 具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。,实时荧光定量PCR技术 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,两个重要概念,(1)荧光域值（threshold,开端？）以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。,(2
22、)Ct值(循环阈值)：C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。,Real-time Q-PCR,在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻,可见Ct值取决于阈值。,荧光定量PCR,相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图（终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性)Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,PCR反应早期：PCR产物产生荧光的水平不能与背景明显地区别,从Ct开始，荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,Ct值与模板的起始拷贝数
23、的关系,经数学证明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，Ct值与模板DNA的起始拷贝数（dRn）成反比：起始拷贝数越多，Ct值越小。,标准曲线：Ct与起始模板量的对数呈反比关系。PCR扩增过程中引入一系列起始浓度的模板与未知样品同时进行扩增，利用该系列模板的Ct值与已知浓度对数做直线回归得到标准曲线，从而计算未知样品的起始模板浓度。,荧光定量标准曲线,实时荧光定量PCR技术的应用,mRNA表达的研究DNA拷贝数的检测单核苷酸多态性（SNPs）的测定病原体的检测肿瘤诊断基因突变、多态性及表达的研究遗传疾病的诊断,存在的问题及应用前景,在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可
24、少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。用real-time Q-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。,Real-time Q-PCR的不足之处（与传统的PCR技术相比）,1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR的复合式（multipl
25、ex）检测的应用能力；3）目前real-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。,RT-Q PCR 存在的问题,在标准曲线定量中，各实验室需要一个统一的标准品；实验成本较高，荧光素种类以及检测光源的局限性，限制了它的应用能力；研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录（RT）效率的限制；相对定量的前提：假设内源控制物不受实验条件的影响，内源控制物的选择也是实验结果可靠与否的关键；不能监测扩增产物的大小（运用封闭检测技术）；,DNA序列测定,DNA测序技术的诞生和发展,1980年，Sanger和Gilbert 因建立DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖（Sanger是第
26、2次获得诺贝尔化学奖）,1977年，美国哈佛大学生化学家Walter Gilbert发明DNA化学降解法测序技术(Maxam 和Gilbert,1977),1977年，英国剑桥医学研究会的分子生物学实验室Frederick Sanger 发明双脱氧链终止法DNA测序技术(Sanger和Coulson)，迄今为止,DNA测序技术的诞生（第一代DNA测序技术）,Sanger法：简便、快速，经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。第二代测序技术（Next-generation sequencing)：费用更低、通量更高、速度更快。,第二代DNA测序技术,现有的技术平台主要包括：Roche
27、/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system。三个技术平台各自的优点：454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，目前第二代测序技术中准确度最高。,核心思想：边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通
28、过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。例如，Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理：在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。,DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止，获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的,双脱氧法(Dudeoxy sequence analyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1977年Sanger 利用此
29、原理建立了双脱氧测序法原理：与加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.,Seq,测序峰图,单分子DNA测序仪,美国Helicos BioSciences公司研究人员近日称，他们开发出了一种新型的测序设备单分子DNA测序仪（single-molecule DNA sequencers）。该仪器能够“阅读”单分子DNA的单个碱基。相关研究文章发表在2008年4月4日的 Science,Science，Vol.320.no.5872,pp.106 109，Timothy D.Harris，Zheng Xie,传统上，在测序之前，要先对DNA链进行扩增。这一过程往往会引入错误，并且对某些DNA片断来说无法很好地实现，从而使得对整个基因组进行测序变得尤为困难Helicos BioSciences公司估计，新仪器能够用8周的时间测序一个人的基因组，代价是7万2000美元，而仪器本身则价值135万美元,1000美元/人的宏伟基因组测序计划,论文第一作者Timothy Harris认为，这一目标将会在5年以内实现,
