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1、中性蛋白酶,中性蛋白酶,1、中性蛋白酶的定义：指能够在中性或弱酸、弱碱性环境中作用的一类蛋白酶，其最适作用pH介于6.07.5,能催化蛋白质肽键水解，具有催化反应速度快,无工业污染,反应条件适应性宽等优点。2、工作机理：中性蛋白酶能在中性条件下水解食品中蛋白质的肽键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒和黄油生产中，添加中性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。,3、中性蛋白酶的分类：中性蛋白酶根据催化机制和活性中心蛋白酶功能基团不同可以分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶四大类。3
2、.1 丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶催化底物蛋白质水解时通常有两个步骤。在水解过程中,随着氨基酸的丢失和肽链的断裂还形成共价酶-肽复合物的中间二聚体。然后脱去酰基,通过水对中间体的亲核攻击,从而使底物肽键水解。大部分的丝氨酸蛋白酶都形成一个典型的SerHisAsp的三联体结构,也有少量以丝氨酸作为催化基础。,3.2 天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸肽链内切酶活性中心依赖天冬氨酸残基。胃蛋白酶家族大部分酶活性中心部位的天冬氨酸残基都位于AspThrGlyXaa的基序中,该基序位于两裂片的氨基端和羧基端。其中Xaa可为Ser或Thr代替，侧链通过氢键与Asp相联。3.3 半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶催化机制与丝氨
3、酸蛋白酶类似，对不同进化来源的几种半胱氨酸蛋白酶催化机制研究发现有极明显相似性。木瓜蛋白酶被认为是半胱氨酸蛋白酶催化机制体现的原型，其催化机制的差异主要由于活性中心构象不一样：丝氨酸蛋白酶包含一个SerHisAsp催化三联体,而半胱氨酸蛋白酶水解过程中有一个酸性基团和酰基硫醇中间体的形成。,3.4 金属蛋白酶金属蛋白酶催化机制稍微不同于上几种蛋白酶,这一大类酶依赖于二价金属阳离子的存在并且能被透析或金属鳌合物失活。通过X-光结晶学研究表明,大多数的金属蛋白酶在晶体形成过程中,酶结构中形成一个用于金属结合的位点,这种金属通常是Zn2+，有的金属蛋白酶活性中心也可能为其它金属阳离子,如Mg2+、C
4、u2+等。酶活性中心的金属离子可为EDTA或OP等鳌合剂所鳌合,从而使酶失去部分活性或全部活力。该过程通常是可逆的,通过重新加入金属离子,酶又可恢复部分或全部活性。,4、微生物中性蛋白酶的来源由于其在生理代谢活动中的特殊作用，中性蛋白酶在动物、植物以及微生物中广泛存在。与其他来源相比，微生物蛋白酶由于在培养条件、生产成本控制以及制备规模上有着无以比拟的优势。微生物中性蛋白酶根据其来源可以分为细菌性中性蛋白酶真菌性中性蛋白酶病毒性中性蛋白酶,4.1细菌性中性蛋白酶在目前市场应用的蛋白酶（主要为中性蛋白酶和碱性蛋白酶）来源中,以细菌蛋白酶最多,特别是芽孢杆菌属细菌,如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。
5、细菌性中性蛋白酶活性大都依赖于二价阳离子,如Mg2+、Zn2+、Ca2+等。也有些其活性不受金属鳌合物的影响,如丝氨酸蛋白酶。细菌蛋白酶水解能力强、速度快,与动植物来源中性蛋白酶水解速度相比,水解产物产生苦味少,所以在食品行业得到广泛的应用。,4.2 真菌性中性蛋白酶很多真菌都能产生中性蛋白酶，如米曲霉、根霉、毛霉等。而且蛋白酶的pH适应性广（pH4-11）。米曲霉可以产生酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。真菌蛋白酶的生产主要通过固态发酵且都是金属蛋白酶,其活性主要依赖于二价阳离子,所以其活性可受到金属鳌合物的影响。一般来说,真菌蛋白酶反应速率和稳定性均相对细菌较低。4.3 病毒性中性蛋白
6、酶对病毒蛋白酶的研究大都集中在医学领域，各种病毒蛋白酶中包含了天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等。所有病毒来源的蛋白酶均为内肽酶，其活性并不需要金属离子的参与。由于其在医学上的特殊作用，越来越多的研究在病毒蛋白酶的三维结构、翻译及表达机理和作用原理等方面展开。,5、中性蛋白酶的应用5.1食品工业中的应用中性蛋白酶被广泛的应用于食品工业中,能够提高食品的品质、稳定性和可溶性等。微生物中性蛋白酶应用于食品业具有以优点由微生物产生,容易实现工业化生产,能够提供价格低廉、充足的酶源一般作用条件比较温和,酶需要量少,副反应少反应过程完成以后酶容易灭活一般比较安全，不含有毒物质。烘焙食品面粉是
7、焙烤加工工艺中一个重要的原料,它含有一种被称作“面筋”的不溶性蛋白,这类蛋白决定了焙烤所用面团的特性。由米曲霉产生的中性蛋白酶通过限制性水解作用,可改变面粉中面筋的性质,细菌来源的中性蛋白酶则可用于提高面团的延伸性和韧性。用酶处理过的面团便于人工和机器对其进行加工,从而生产出较多种类的产品。,5.1.2 饮料澄清和肉类嫩化罗盈昌等人研究了绿茶、乌龙茶、红茶的浸出液经中性蛋白酶酶解后,其超滤通量的变化。其中绿茶和乌龙茶的超滤通量基本没有变化,而红茶因其可溶性蛋白含量较高,经过中性蛋白酶酶解后,通量变化较显著。所以中性蛋白酶可以在茶浸出液膜分离中的应用,特别是在红茶中的应用有非常诱人的市场前景。另
8、外,中性蛋白酶还能用于肉类嫩化,主要是因为中性蛋白酶能将肌原纤维与弹性蛋白溶解从而变成无规则的结构,因此,酶处理后肉质得到了嫩化。,豆制品中性蛋白酶在豆制品的加工过程中起着重要的作用。以豆瓣酱为例，发酵过程中真菌(以霉菌居多)所产生的中性蛋白酶使大豆原料中的蛋白充分水解，在为微生物提供必需的生长因素的同时，也促进了许多有益氨基酸的生成，有效地增加了产品的营养成分。用于阿斯巴甜糖的合成阿斯巴甜糖是一种无热量的人工合成甜味剂,是由L-天冬氨酸与甲酯L-苯丙氨酸组成的二肽,两种氨基酸的L-构型有利于甜味的形成。因此,立体结构特性的保持是至关重要的,通常是通过化学方法来保持其立体结构。尽管蛋白酶通常被
9、认为作为一种水解酶,但在特定的动力学控制条件下可以催化逆反应合成阿斯巴甜。,5.2 皮革工业中的应用皮革加工包括浸透、去毛和软化等过程，传统的工艺主要采用化学方法处理，在加工过程中不可避免地会使用到强腐蚀性物质，既不利于生产，也容易导致环境污染。酶替代化学药品在提高皮革质量与减少环境污染证明是颇有成效的。蛋白酶主要被用于选择性的水解皮肤中的非胶质组分与去除非纤维蛋白,如清蛋白与球蛋白等。将蛋白酶应用于皮革工业中,可以减少浸泡时间。中性蛋白酶酶制剂的选择依赖于矩阵蛋白（如弹性蛋白和角蛋白）的特异性,酶用量取决于被处理皮革的软硬。酶制剂在皮革制品加工中的应用不仅有利于减少环境的污染而且还能节约能源
10、。,5.3化妆品中的应用中性蛋白酶在化妆品的生产与开发中得到广泛。用于化妆品的中性蛋白酶多来自于微生物和植物。将中性蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢,尤其是枯草芽抱杆菌中性蛋白酶效果最好。面霜等添加中性蛋白酶,可溶解皮屑,使皮肤柔软,促进皮肤新陈代谢,增加皮肤对药物之吸收,使皮肤角质层中致病菌的耐药性降低。同时,微生物来源中性蛋白酶较耐热且能除去老化角质层细胞、增强清除效果、防止青春痘形成。,5.4医药工业中的应用在医药工业中蛋白酶被用于制备药剂,如伤口清创的药膏、烧伤疤痕软化、消炎消肿、祛痰等。中性蛋白酶具有广泛的多样性和底物特异性,使其在研发高效治疗药剂方面优势明显。来自米曲霉
11、的中性蛋白酶可被用作消化助剂,纠正某种裂解酶缺陷病症。梭菌胶原酶或枯草杆菌蛋白酶联合广谱抗生素用于治疗烧伤和创伤。由枯草芽孢杆菌产生的中性金属蛋白酶能特异性的水解纤维蛋白和胶原蛋白,所以广泛应用于皮肤病学上。,6、中性蛋白酶的发展趋势从目前国内中性蛋白酶发展以及研究报道来看,我国中性蛋白酶的研究总体水平仍处于一个起步阶段。大量研究表明,采用基因工程与传统的微生物育种方式结合来提高菌种产酶量是一条值得继续探索的发展途径。今后发展的方向主要有以下几个方面：继续通过基因工程与传统的微生物育种技术进一步提高微生物产酶能力。采用酶体外定向技术改变酶的底物特异性与适应性,如底物亲和力、适应性、耐热性以及耐氧化性等等。为开拓酶的新应用领域做出贡献。继续寻找产中性蛋白酶新的菌种,特别是极端微生物源中性蛋白酶显得尤为重要。在应用方面,继续开发酶的应用领域,同时,积极开展理论与应用研究,为酶在食品与其它行业的发展做出贡献。,
