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1、第五章亲和层析分离技术,Affinity Chromatography,第一节亲和层析概述,亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术,历史,1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。生物大分子的分离,优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和缺点：1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分离对象就需要制备专一的吸
2、附剂和建立相应的实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤,第二节亲和层析基本原理及理论基础,原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。,亲和力,生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。,固相化(Immobilise)配体Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。即被固定在基质上的分子称为配体。基质Matrix(载体):亲和层析中与配体共价结合,使其固相化的物质。,吸
3、附(Adsorption)解吸(Elution),一、亲和层析基本原理,基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。,含配体溶液,收集目的蛋白,洗下未结合的蛋白,混合蛋白样品,平衡液,带有配体的树脂珠（或胶粒）,分离过程,将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合（静电引力、范德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上），从而留在固定相上而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液
4、的pH或增加离子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质,二、亲和层析的特点,分辨率很高 分离速度快 操作简便 对设备要求不高 亲和吸附剂通用性较差 洗脱条件较苛刻,与其他层析技术比较,吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分离。由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性
5、质亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。,三、亲和层析的类型,生物亲和层析 免疫亲和层析 固定化金属离子亲和层析 拟生物亲和层析,生物亲和层析,利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。,免疫亲和层析,免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进
6、行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。,固定化金属离子亲和层析,1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如Cu+螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。,固定化金属离子亲和层析,固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，
7、螯合基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选择性的吸附蛋白质。目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据。金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。,拟生物亲和层析,定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或某特定部位。以人工合成的配体为固定相吸附目的蛋白质的亲和层析，例如染料亲和层析（DAFC）和氨基酸亲和层析(AALA)。染料配体，
8、例如三嗪或三苯甲烷化合物，能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用，以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂的形式进行。,四、亲和层析载体,（一）亲和层析对载体（基质）的要求极低的非特异吸附性大量的化学基团能被有效的活化，而且容易和配体结合有较好的理化稳定性和生物惰性 有高度的水不溶性和亲水性。载体的亲水性往往是保证被吸附生物大分子稳定性的重要因素之一。同时，亲水性有助于亲和对达到亲和平衡，并减少因疏水力造成的非特异性吸附。载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过。,载体在亲和层析中的作用：,使配体固定化、提供结合的空间环境,（二）常
9、用载体,纤维素 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 葡聚糖凝胶 多孔玻璃珠,1.纤维素,它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中的mRNA。,2.琼脂糖凝胶,是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和Ultrogels
10、 A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。例如，Sepharose 4B的分子量排阻极限达上百万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团，非专一性吸附少。Sepharose CL是用1,3-二溴丙烷处理的交联琼脂糖，它的稳定性明显增加，能在pH 314中应用。,3.聚丙烯酰胺凝胶,是由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺经催化聚合形成的人工合成载体，是具有网状三维空间结构的凝胶型高聚物，商品名为Biogel P。与葡聚糖凝胶一样，它也是一种干胶，遇水后溶胀成多孔凝胶。它具有稳定的理化性能，适用于稀盐溶液、洗涤剂、盐酸胍等溶液和许多
11、有机溶剂，不受酶或微生物代谢产物的影响；有较多的可供化学反应的酰胺基，能制得配体含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。但是pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。,4.葡聚糖凝胶,是经环氧氯丙烷交联，具有立体网格的多糖类物质，其物理及化学性能比较稳定。与琼脂糖凝胶相比较，葡聚糖凝胶孔径太小，特别是经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小，所以它的应用也受到一定限制。亲和柱的不可逆吸附杂质(如变性蛋白、脂类等)可用强碱处理除去。,5.多孔玻璃珠(商品为Bio-Glass),它的化学与物理稳定性较好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点是亲水性不强，对蛋白
12、质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass的商品都已事先连接了氨烷基(烷基胺)。用葡聚糖包被玻璃珠则可改善其亲水性，并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。,五、亲和配体,（一）配体的选择 配体与待分离的物质有适当的亲和力 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性 配体要能够与基质稳定的共价结合 配体自身应具有较好的稳定性,（二）配体的浓度（三）配体偶联的位置（四）配体分子的大小（五）配体的类型,配体的浓度,在亲和势比较低的时候，
13、增加配体浓度有利于吸附。配体浓度太高容易使大分子配体上的活性中心互相遮盖，反而使亲和柱吸附力降低。配体浓度太高又会使吸附力太强，造成洗脱困难。,配体偶联的位置,在一般情况下，亲和结合时配体分子与待分离物质仅有一部分发生相互作用。为了保证亲和吸附剂有足够大的亲和能力，我们希望配体固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。,配体分子的大小,制备亲和柱时，应首先选用大分子配体，因为小分子配体可供识别、互补的特殊结构较少，一旦偶联到载体上后，这种识别的结构更少。小分子配体时，由于酶的活性中心常是埋藏在结构的内部，它们与载体的空间障碍影响其与亲和配体的结合作用。为了改变这种情况可在载体和配体间插入
14、一个“手臂”以消除空间障碍，手臂的长度是有限的，太短不能起消除空间障碍的作用。太长往往使非特异性的作用如疏水作用增强。,配体的类型,根据配体对待分离物质的亲和性的不同，分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。特异性配体：一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。通用性配体：一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体。配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、以及氨基酸等），它成本低廉，具有较高的吸
15、附容量。,第三节亲和层析的操作过程,一、基质的活化 对基质进行一定的化学处理：使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。,溴化氰活化,环氧乙烷基活化,聚丙烯酰胺的活化,二、间隔臂分子（手臂）,空间位阻效应：待分离生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体。加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长。,三、配体偶联的方法,（一）碳二亚胺缩合法（二）酸酐法（三）叠氮化法（四）重氮化法,碳二亚胺缩合法,酸酐法,用-氨基烷基琼脂糖(或丙烯酰肼衍生物)与1%的琥珀酸酐水溶液作用，生成琥珀酰氨烷基琼脂糖衍生物(含羧基的载体)。,叠氮化法,重氮化
16、法,氨基烷基琼脂糖衍生物，在pH9.3的硼酸钠(或三乙胺)和40%(V/V)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，与对硝基苯叠氮化合物在室温反应1 h，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。产品先依次用50%DMF、25%DMF和水充分洗涤，接着用0.1 mol/L连二亚硫酸钠在4050还原40 min，最后在0、0.5 mol/L HCl溶液中用0.1 mol/L亚硝酸钠处理7 min，制得重氮盐衍生物。将所需配基与该琼脂糖重氮衍生物偶联反应，便可制得亲和层析柱。,四、用于固定化配体的凝胶衍生物,Sepharose CNBr活化的Sepharose 4BAH-Sepharose 4B和CH-S
17、epharose 4B 环氧活化型Sepharose 6B,五、影响吸附剂亲和力的几个因素,微环境的影响 空间障碍的影响 配体浓度对亲和力的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响,（一）微环境的影响,所谓微环境在这里主要指化学方面的，包括载体及“手臂”的电性、极性，甚至于次级化学建对配体亲和力的影响。载体和“手臂”的存在会引起离子交换作用的发生，影响亲和吸附剂的吸附特异性。在选择载体和“手臂”以及进行连接反应时，都应避免引入含离子键的基团。极性很低或无极性的基团则由于疏水作用的存在，也会引起非特异性吸附作用，大大降低亲和层析效果。配体与载体和“手臂”氢键的相互作用可能会使其强烈缔合，
18、从而妨碍了与待分离物质的亲和结合。,（二）空间障碍的影响,有的亲和对两物质间原有很高的亲和力，但当其一方制成亲和吸附剂时，与相应配体的亲和力可能完全丧失。除了配体与载体不适当偶联时可能发生分子结构变化外，很可能是空间位阻造成的。需要在载体与配基之间插入一段适当长度的“手臂”。减少基质的立体位阻效果，增加配体的活动度。,（三）配基浓度对亲和力的影响,对于低亲和力系统（解离常数较大的配体而言），为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配体的有效浓度。,（四）配体与载体的结合位点的影响,在多肽或蛋白质等大分子作配体时，由于它们具有数个可供偶联的功能基团，必须控制偶联反应的条件，使它以最少的键与载体
19、连接，这样有利于保持蛋白质原有的高级结构，从而使亲和吸附剂具有较大的亲和能力。即配体与基质以最少的键连接。,（五）载体（基质）孔径的影响,载体的孔隙是待分离物质向配体接近的运动通道。所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响。例如：对分子量较小的葡萄球菌核酸酶，用Sephrose 4B制得的吸附剂，比用Bio-Gel P-300制得的有高得多的亲和力。因为配体多位于凝胶环内，Bio-Gel P-300的孔径不够大，阻碍了配体的进入。,六、亲和层析的基本操作,亲和吸附剂选择制备 上样 洗脱 亲和吸附剂的再生和保存,（一）上样,上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子
20、强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。,（二）洗脱,特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱。例如：凝集素-糖蛋白（单糖洗脱）一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。例如：染料-脱氢酶（NAD+洗脱）非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。,（三）亲和吸附剂的再生和保存,再生就是指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法去除吸附在其基质和配体（主要是配体）
21、上结合的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力 一般情况下，使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。亲和吸附剂的保存一般是加入0.01%的叠氮化钠，4下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。,第四节 亲和层析的应用,1.分离和纯化 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质 结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理,Figure 1.Loading affinity column.,Figure 2.Proteins sieve through matr
22、ix of affinity beads.,Figure 3.Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly.,Figure 4.Wash off proteins that do not bind.,Figure 5.Wash off proteins that bind loosely.,Figure 6.Elute proteins that bind tightly to ligand and collect purified protein of interest.
23、,亲和层析法分离豌豆凝集素,原理 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用的差异来进行鉴定。,器材 1.层析柱2.恒温孵育箱3.反应板,试剂1.1mol/L NaCl洗脱液2.0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液3.Sephadex G-504.兔红细胞悬液 5.样品液：杂蛋白和凝集素,操作,1.亲和层析分离 Sephadex G-50装柱，用1mol/L NaCl洗脱液平衡5分钟,加样6滴。（方法同凝胶层析）加样后立即开始收集洗脱液，每管收集3ml，控制流速1015滴/分钟，待杂蛋白洗脱后，开始换0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液进行洗脱，每管收集3 ml。收集约10管后，用1mol/L NaCl洗脱液平衡柱5分钟，此柱即可再生。,2.豌豆素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置37保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结果。,思考题,1、亲和层析分离原理及优缺点。2、亲和层析分离基于哪些作用力，在什么场合下，亲和色谱剂需要手臂？3、影响吸附剂亲和力的几个因素？4、亲和层析的基本操作？,
