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1、分子克隆载体,周 俊 宜,基因工程的表达体系 操纵子理论在基因工程中的应用目的基因翻译表达及其准确性常用基因载体,基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒,基因工程的表达体系,原核生物表达体系：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌,大肠杆菌表达体系的优点：积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；可因不同载体而选择不同菌种作宿主；操作安全，致病能力低；成本相对低得多；真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。,缺点
2、：原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；没有加工所需的酶系统；热源、内毒素不易除去；常会形成包涵体。,表达体系的发展 表达体 载体 宿主第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞第四代 基因直接导入 DNA本身 生殖细胞、体细胞、个体,基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。,
3、操纵子理论在基因工程的应用,一、启动子与转录调控,原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。,结构基因,调控序列,操纵子,P：启动序列 O：操纵序列 I：调节序列,I,P,O,CAP,调控区,Z Y X,结构基因,以乳糖操纵子（lac operon）为例：,Z Y X,I,P,O,CAP,Z Y X,I,P,O,CAP,二、强启动子的构建,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recogni
4、tion site),结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,Ptac启动子 Ptrp与 Plac的杂化产物 Ptac比原来各自的活性强-35区-10区 Ptrp TTGACA TTAACT 共有序列 TTGACA TATAAT Ptac17 TTGACA TATAAT,乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物,三、蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）,Z Y X,P,O,Z Y X,
5、P,O,乳糖,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,转录终止：非依赖因子的转录终止需要茎环结构，以t（termination）代表。,C G G C C G C G G C,C,U,A,A,U,G,A,5AUACCA UUUUUUUUU3,四、转录终止结构的插入,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,五、增强子 转录起始前-30区为TATA盒，还有多种顺式作用组件相互配搭成启动子。增强子 远距离地、不同方向地控制启动子的活性。增强子的核心序列
6、是TGTGGAATTAG。增强子的作用特点有：非特异性远距离操纵、多方向性。酵母结构基因的上游还有上游活化序列（upstream activation sequence，UAS）。,目的基因翻译表达及其准确性,核糖体结合位点（S-D序列）,mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列(Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。,3 A CACUAGG5 16sRNA,U C,U-C-C-U,5A G G A PuPuUUUPuPuAUG mRNA,AGGA后的的7个Pu是核糖体小亚基的辨认部位,lF1、3,GDP+Pi,lF2,lF1、3,基因克隆时的定向插入,插入序列两边的酶切口
7、不同,插入的组件不会倒装，保证了在其下游目的基因插入后，沿53方向正确转录，这种构建方式称为定向插入。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,APR,pUC19,如果插入序列自身不含ATG起始密码,或限制酶切点不能把读码框准确置于ATG之后,或插入片段编码未清楚,可在目的基因之前设保险序列:5ATGNATGNATG 5ATGNATGN ATG 123 456 5ATGN ATG NAT GXY 123 456 5ATG NAT GNA TGZ 123 456,能正确读出三联体密码的起始序列,TAA,ATG,I II III IV V,I V,I II V,ATG,I II II
8、I V,I,II,III,Ori,转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区,CS,CS,CS,CS-cloning site,常规质粒载体,质粒(plasmid),Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。Plasmid chromosome,基因载体应具备的条件：（1）有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好只有1个；（2）有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验；（3）有一定容量；（4）有相当的抄本数，即每个宿主菌可能容纳的最多数。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,1、质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子。2、
9、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制。4、质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。,质粒的生物学特性,5、根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。6、质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。,
10、第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,发展概况,pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成
11、。可见其原型质粒在使用上有优点。,pBR322,有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。,普通型载体pBR322的结构图,抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,pUC质粒系列,pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含L
12、acZ不得基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。lacZ之内是M13的多功能连接器。,三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到
13、M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,pKO系列,组成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位点包括terr，.表达产物催化 Gal+ATP Gal-1-P+ADP以14C标记的半乳糖作底物,检测生成的*Gal-1-P的放射性。,在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算启动子功能的强弱。如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。,噬菌体载体,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以
14、认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖（图1-5）。图左示噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。,噬菌体的生活周期：裂解侵入细菌-独立复制-裂
15、解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。,噬菌体的结构和用途,噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 531bp，含50多个基因。,噬菌体基因大致分为4个区：结构区A J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和N、CI基因，O-R 为裂解区.,噬菌体及其组件的应用,噬菌体可以容纳较大的目的基因。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因。基因文库构建常使用载体；不少先进的质粒应用组件进行构建。,噬菌体从溶原转为
16、裂解是一种可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:分离得到某些噬菌体，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。cl ts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在cl ts857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。,CIts857,ori,目的基因,PL,阻遏蛋白,30下培养：,目的基因,阻遏蛋白,42下培养：,失活,PL和 PR,PL和PR 是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr
17、基因，成为以启动子为组件的质粒。,（1）粘粒（cosmid）能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb 6kb）载体。组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的cos位点。,构建基因文库的载体,（2）DNA的体外包装 是提高噬菌体转染效率的有效方法 在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部。,高效表达质粒,组成特点:强启动子,保证正确阅读AUG的序列ATGNATGNATG，rrnB抗终止序列，多位点接头。,pBV系列质粒 pBV221分子量小，易转化，含有串联的来自噬菌体的强启动PL及PR，启动子的串联可能有相互增强作用。含
18、有CIts857组件，此组件可变温诱导目的基因的表达。这一组件的存在，还可适当地抑制宿主菌的蛋白酶活性，达到提高表达量的目的。,带有真核生物基因表达组件的质粒 真核生物与原核生物催化转录、翻译及其后修饰的酶和起始复合物的结构不同，医学研究需要能表达真核生物基因的表达载体。由于病毒对宿主细胞有依赖性和可整合性，真核表达组件不少来自病毒。如巨细胞病毒（CMV）启动子，猿猴病毒SV40的组件等。,酵母质粒和大容量载体,酵母是单细胞真核生物，可接受质粒转化。酵母质粒有Yip（integrate）整合型，Yep（epi-some）附加体型，Yrp（replication）复制型。,pYEJ001 一种以
19、pBR322为基础的酵母质粒，两个抗药基因及左下方的半圆来自pBR322，右上半圆来自酵母，包括启动子、糖代谢酶类及氯霉素抗性基因，可在大肠杆菌体系重组再转化酵母细胞 称为穿梭质粒（shuttle plasmid）,昆虫杆状病毒（baculovirus）如核型多角体病毒ACNPV，昆虫体系的优点是表达效率高，目的基因插入的容量相对大，使用安全等。目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。,YAC酵母人工染色体 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。pYAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的基因工程。主要用于人类基因组研究和巨大基因如DMD基因达Mbp（106bp）数量级基因的克隆。,
