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1、单克隆抗体制备,Monoclonal antibody 单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗原决定簇的抗体。分三个阶段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立筛选方法和程序（3）杂交瘤的生成,一、动物免疫,1 Balb/c小鼠6-8周龄，25g左右，雌性较佳2 免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5 ml抗原与福氏完全佐剂 1：1的混和液，一般2-3只鼠（2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂,（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫 3天后，去脾脏融合 对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体 程序依抗原性质而定。,可溶性蛋白（提取或表达的蛋白）50-100g颗粒性蛋白（病毒）50-1
2、00g细菌 106CFU活细胞（哺乳动物细胞）105-7CFU活癌源细胞 104-6CFU糖类（多糖、糖蛋白）100-200g核酸 100-200g,1 在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以 MEM培养基复苏，37 CO2 培养箱中培养2 在对数生长期收获107-108CFU的 SP2/0细胞3 500 g离心5min，弃上清4 轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20 mL MEM营养液中,二、骨髓瘤细胞的培养,注意要点：1 如细胞外观不健康，或生长密度不好，应检测是否 有支原体污染2 一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免长期培养3 融合的细胞要处于对数生长期,三、饲养细胞的制备,1 取清洁级I
3、CR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min2 将小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入小鼠腹腔,5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次，将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用6 将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心 5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培 养瓶内待用,注意事项：1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2 吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否 则会造成污染3 如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的 位置，重新吸取细胞液,四、脾细胞的制备,1 取Balb/c小鼠2只，
4、断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min2 将小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔4 小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培 养皿内,5 用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾 细胞分离出来6 用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离 心管中，沉降5min7 将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心 5min，弃上清，沉淀以20mL MEM培养基重悬,注意事项：1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2 取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心，不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破3 如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，应选用备用小鼠的脾脏,五、细胞融合及培养
5、,1 以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细 胞融合管中2 在室温下500g离心10min，弃上清3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置 37水浴4 在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37 PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次,5 在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至37的MEM培养基加至融合管中37水浴5min室温下500g离心10min，弃上清在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加入HAT培养基30mL，后加入10-15mL饲养细胞悬液,9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔2-mL10 将细胞培养板置37 饱和湿度的CO
6、2 培养 箱中培养11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况,12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/213 7-8天用HT培养基换液，全部换液14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里 的抗体。,注意事项：1 脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1 5：1最好2 细胞融合是关键步骤，避免用力吸打3 细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括 细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去4 换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸出或冲散,六、杂交瘤细胞的筛选,大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛选。
7、筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。,注意事项：1 因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗体。如 单用酶标记抗IgG抗体，则IgM类单抗就不能被筛选出来。2 阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗的方法最好,七、杂交瘤细胞克隆,在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来
8、说，杂交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。,1 在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲养细胞的96孔板2 将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀3 血液计数板计数4 在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行10倍比稀释,5 当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至96孔板中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔6将细胞培养板置37 饱和湿度的CO2 培养箱中培养10天左右，注意观察7 大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7天换液一次，8 10天左右克隆长满，可以检测上清,注意事项：1 上清液要在24
9、h内测定2 细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞为深蓝色，且没有光泽3 如有高质量的FCS，可不用饲养细胞4 一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定5 如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加1mol/mL的Cu SO4溶液,七、实验室规模抗体制备,体外上清液培养1 杂交瘤细胞先在25mL 的细胞培养瓶中培养2 细胞长满瓶底后转至50或100mL的细胞培养瓶中培养3 当细胞液变黄后，收集上清液，再加新鲜的培养液，并重复收集上清2次4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并收集上清,体内生产腹水1 正常培养杂交瘤细胞2 饲养Balb/c小鼠，注射细胞一周前通过腹腔注射0.5mL降植烷3 在细胞对数生长期收获细胞，并进行计数，将细胞数量以培养液调整至（2-10）107CFU4 小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液，1-2周后发展成癌性腹水,5 用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠 可收集2-3次6 腹水5000g离心10min，收集澄清的上清，除去油脂7 加入0.05%的叠氮钠，小量分装保存。长期 置-70保存；备用4 保存,八、杂交瘤细胞的保存,1 培养杂交瘤细胞至对数生长期2 弃去细胞培养上清，以Hanks液洗涤一次3 弃去洗涤液，加入含10%DMSO、10%犊 牛血清的MEM培养基，吹打细胞4 将细胞悬液加入细胞冻存管，每中等细胞培 养瓶分两管，先放-70冰箱冻30min，然后置液氮罐中保存,
