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1、,课程网址,构型(configuration)和构象(conformation),Configuration：The geometrical arrangement in polymers arising from the order of atoms determined by chemical bonds.Conformation：The geometrical arrangement in polymers arising from rotation about adjacent carbon-carbon single bonds.构型的改变，分子中一定会有共价键的断裂和新的共价键的生
2、成；而构象的改变不需要共价键的变换,构型异构体还是构象异构体？,Isotactic,Syndiotactic,构型异构体还是构象异构体？,Techniques in receptor research,尹长城北京大学医学部生物物理学系,3.受体与配基结合的动力学,3.1 受体放射配基结合分析,60年代初在受体研究中采用放射性标记核素 并建立了受体放射配基结合分析(radioligand binding assay,RBA)，它的理论基础是占领学说该理论认为受体与配基以单分子相互结合(分子比为1:1)反应服从质量作用定律,反应是可逆的配基在结合和解离后不被代谢，也不与其它类型受体结合受体与配基结
3、合后产生的生物效应的强度与受体被占领的量成正比,3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达,受体与配基结合作用的反应式如下:根据质量作用定律，结合反应速率为 v1=k1RL,解离反应速率为 v2=k2RL当反应达到平衡时,v1=v2，所以（1）R、L、RL分别为游离受体、游离配基、受体-配基复合物的摩尔浓度k1、k2分别是结合速率常数、解离速率常数Kd是解离平衡常数，单位为mol/L;Kd值的大小作为衡量配基与受体相互结合能力的一个重要物理量:Kd值愈小结合能力愈大;Kd又称为亲和常数,R,+,L,R,L,k,1,k,2,3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达,设：RT为受体的初始浓度（2
4、）重排并整理得：（3）上式即Scatchard方程，以RL/L为纵轴，以RL为横轴作图得一直线直线斜率为-1/Kd,横轴截距为RT,纵轴截距为RT/Kd,Scatchard图,3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达,同理可推出：（4）上式为Woolf方程：以L/RL为纵轴，以L为横轴作图得一直线直线的斜率为1/RT,横轴截距为-1/Kd,纵轴截距为Kd/RT,Woolf图,3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达,同理还可推出：（5）上式为Lineweaver-Burk方程，亦称双倒数方程：以1/RL为纵轴，以1/L为横轴作图得一直线直线的斜率为Kd/RT,横轴截距为1/Kd,纵轴截距为
5、1/RT,Lineweaver-Burk图,3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达,设：LT是总配基浓度,L=LT RL,将 L=LT RL 和 R=RT RL代入(2)式，经整理得：（6）上式为以RL为变量的双曲线一元二次方程当RT、Kd固定时，RL随LT的变化而变化，开始上升很快，以后逐渐趋向水平，这就是饱和曲线,受体与配基结合曲线,SB为特异性结合，NSB为非特异性结合，TB为总结合SB=TB NSB,3.1 单位点受体与配基结合反应的数学表达,将(1)式重排变成下式：（7）设RL=RT,L=L1/2,带入上式，得整理，得 Kd=L1/2结论：在50受体结合配基时,体系中游离配基的浓
6、度就是受体的解离平衡常数Kd值,3.2 双位点系统,一种配基可以和两种受体结合，这两种受体往往是某类受体的两种亚型选用某种放射配基，进行饱和实验，用Scatchard 作图法得到的不是直线而是向上凹的曲线；这条曲线是由高低亲和性不同的两条直线加合成的,双位点系统,饱和曲线,Scatchard曲线,双位点系统,近年来发展了很多方法用来进行双位点系统受体亚型的研究用选择性放射配基进行多点饱和实验用非选择性放射配基和选择性非放射配基进行竞争性取代实验 原则上它们也可以用于多种亚型的分析，但是由于配基选择性的限制及实验误差的存在等原因,多数成功的例子仅限于双位点系统,3.2.1选择性放射配基的饱和曲线
7、,选择性放射配基，对一种亚型有高亲和力,而对另一种亚型则为低亲和力 多点饱和实验显示，随着LT加大，RL先是因高亲和力的大部分结合趋向饱和，然后由于低亲和力亚型结合增多，曲线又住上翘 用Scatchard作图得到的不是直线而是向上凹的曲线，也就是说，随着LT增加，曲线前部分斜率很陡(高亲和力亚型结合)，然后斜率平坦(低亲和力亚型结合),3.2.1选择性放射配基的饱和曲线,应该指出，即使LT很小时，低亲和力亚型也不是完全不结合，所以不能把饱和曲线或Scatchard 曲线截然分成两段，前一段是高亲和力亚型结合，后一段是低亲和力亚型结合。实际上每段曲线都是两种亚型结构的总和，只是每种亚型所占比率多
8、少不等而言在实际分析数据工作中，首先需用合理的受体结合反应的数学模型，然后是运用计算机程序处理，才能得到两种亚型受体的RT和Kd值,双位点饱和实验法,运用Scatchard方程分两种受体亚型，由于系统中放射配基L是相同的,它们各自的结合方程为实际上，实验中测量得到的是RL,而不是RL1和RL2,由于RL=RL1+RL2,所以（8）上式中RL,L是实测值,RL1、RL2、Kd1、Kd2为四个待测参数。只要有足够多的实验点，就可以用最小二乘回归法去求四个参数，并根据参数再拟合成两种亚型的图形,3.2.2 非选择性放射配基和选择性非放射配基竞争结合,选用放射配基对两种亚型受体的亲和力相同，选用非放射
9、配基对一种亚型有高的亲和力，对另一种亚型则是低亲和力在一定浓度的放射配基和受体系统中加入不同浓度的选择性非放射配基作竞争结合反应。高亲和力的配基容易与受体结合而取代放射配基，表现为部分结合位点在低浓度竞争剂即明显丧失放射性，而另一部分受体在高浓度竞争剂时对放射配基有明显抑制作用和双位点饱和曲线一样，这种区分不是绝对的。必须通过计算机拟合才能得到两种亚型的各自参数,3.2.2 非选择性放射配基和选择性非放射配基竞争结合,如果只有一种亚型受体系统，放射配基和选择性非放射配基(抑制剂)与受体反应，则体系中R是共同的，解上述联立方程，得：如果体系中有两种亚型受体，则（9）,3.2.3 正负协同作用,何
10、谓正负协同作用？它是指当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变的现象亲和力下降称之为负协同作用；亲和力增大称之为正协同作用在Scatchard图中，曲线斜率变小为负协同作用；曲线斜率变大为正协同作用,Scatchard 图与正负协同作用,Hill方程与正负协同作用,用Hill作图法可判别协同作用的性质。其原理如下：倘若一个受体可以和n个配基结合，并且Kd值相同,则移项，得两边取对数，得（10）,Hill方程与正负协同作用,以 为纵坐标，lgL为横坐标作图：直线的斜率为n，称为Hill系数,Hill系数与正负协同作用,令,则由于kd值不变，如果：n=1,L1/2=Kd,简单单位点系统
11、n Kd,体系中游离配基，受体亲和力，负协同作用n1,L1/2 Kd,体系中游离配基，受体亲和力，正协同作用,3.2.4 反应速率常数的测定,测定受体-配基反应的速率常数是研究受体反应动力学性质的一种研究方法反应速率常数有结合速率常数k1和解离速率常数k2反应达到平衡时其k2/k1的值就是Kd，即平衡解离常数。用此法测得的Kd值与饱和实验所得的Kd值在理论上是一致的,结合速率常数,根据质量作用定律:v1=k1RL,v2=k2RL复合物RL生成的速率为（11）设受体总浓度为RT，配基总浓度为LT,则 设 LTRT,在反应过程中LT变化很小，则（12）,R,+,L,R,L,k,1,k,2,结合速率
12、常数,当反应达到平衡时，dRL/dt=0，设此时复合物的浓度为RLe,则（13）将（13）式带入（12）式，得 整理，得（14）,结合速率常数,（14）式积分，得（15）（13）式整理，得（16）将（16）式带入（15）式，得（17）令k表=k2+k1LT 为表观速率常数(复合物净生成速率常数)，则（18）,解离速率常数,当受体与配基的结合反应达到平衡时，加入大于100倍量的非标记配基，使标记配基与受体不再结合而且平衡破坏，受体标记配基复合物发生解离，其速率为（19）重排，得（20）,解离速率常数,（20）式积分，得（21a)或(21b)当RL=RLe时,t=T1/2（复合物解离一半的时间）所
13、以（22）,受体-放射配基反应复合物时相曲线,RLe,T1/2,t=0,速率常数测定,根据(B)曲线求复合物解离一半所需时间即T1/2，由（22）式求出k2根据(A)曲线不同时间测得RL，以lnRL/RLeRL为纵坐标，t为横坐标作图，图中直线斜率由(18)式知其为k表值由k表=k2+k1LT，便可求得k1值,3.2.5 受体的竞争性和非竞争性结合反应,在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体结合,则会抑制放射配基与受体的结合反应加入的化合物称为受体反应的抑制剂,抑制剂可以是激动剂，也可以是拮抗剂拮抗剂按其作用机制又可分为竞争性拮抗剂和非竞争性的拮抗剂,3.2.5 受体的
14、竞争性和非竞争性结合反应,竞争性拮抗剂的抑制作用是它与激动剂竞争受体的相同或邻近的部位，竞争性拮抗剂与激动剂对受体结合作用是相互排斥，竞争性拮抗剂与受体结合只减少激动剂与受体的结合数量竞争性拮抗剂与受体结合后，不改变受体分子的结构,受体仍可与激动剂继续结合,而且可完全排除竞争性拮抗剂，表现出可逆反应的特性非竞争性拮抗剂与受体结合后,则改变受体分子的结构，激动剂不能排除拮抗剂，表现为不可逆反应特性对拮抗剂竞争类型的鉴别是十分重要的,鉴别的方法通常用双倒数作图法,或Scatchard 作图法,受体的竞争性和非竞争性结合反应,R+L,RL,+,I,RI,Kd,Ki,Ki,竞争性Competitive
15、inhibition,非竞争性Noncompetitiveinhibition,+,I,RLI,竞争性拮抗的数学表达,(a),(b),(c),将b,c带入a,得,重排，得,竞争性拮抗剂双倒数图,图中的I0是抑制剂浓度为零,I1是拮抗剂浓度为I1直线的斜率为横轴截距为纵轴截距为1/RT竞争性拮抗剂的特点是随拮抗剂浓度的增加受体的结合位点数不变,而亲和性变小,1/RT,竞争性拮抗剂的Ki值,拮抗剂Ki值称拮抗剂的抑制常数,或称拮抗剂的解离平衡常数有竞争性抑制剂存在的平衡常数Kd表称为表观解离平衡常数,Kd表与Kd的关系如下:所以（23）Ki值是表征拮抗剂与受体结合能力的物理常数,不受实验条件而变化
16、,非竞争性拮抗的数学表达,重排，得,非竞争性拮抗剂双倒数图,直线的斜率为横轴截距为纵轴截距为如果Ki=Ki,则随拮抗剂浓度的增加受体的亲和性不变,而受体的结合位点数变小,非竞争性拮抗剂的Ki值,拮抗剂浓度I1时,双倒数图曲线的斜率为拮抗剂浓度I0时,双倒数图曲线的斜率为所以（24）,拮抗剂的IC50值,表征拮抗剂抑制作用强弱的另一个常用指标是IC50值(或称I50),IC50定义为抑制50受体结合反应时所用抑制剂的浓度 IC50值大，表明拮抗剂抑制作用小，但它不是特征常数，随实验所用的RT，放射配基含量不同而变化,不同抑制剂只能在同批实验条件下可作比较IC50值只表明拮抗剂抑制作用大小,它不能
17、指出抑制剂是属于什么性质的抑制作用,IC50值求解的实验方法,IC50与Ki的关系,对竞争性抑制而言，结合放射配基的表达式为（25）I=0时，I=I50时，即整理，得（26）,IC50与Ki的关系,由(26)式可知,当Kd、L相同条件下，Ki正比于IC50。因此，在同一实验条件下，可以比较不同拮抗剂的IC50值，来判断受体亲和作用大小(26)式中的L是反应平衡时游离标记配基的浓度,如果RT值远远小于总标记配基浓度LT,结合配基浓度RL很少,那么LT近似等于L,式中的L即可用LT代替,IC50与Ki的关系,利用IC50值确定Ki值时必须注意:(1)受体的浓度RT远远小于总标记配基浓度LT,否则会
18、引起较大误差(2)拮抗剂属于竞争抑制结合,才能利用(26)式,所以当不知道拮抗剂抑制性质时是不能利用IC50求Ki值值得注意的是,Ki与IC50都可判断受体亲和作用大小,但是IC50只有在同一实验条件下,比较各拮抗剂的抑制作用;而抑制剂的Ki值不随实验条件变化而变化,只要是同一个抑制剂,即使在不同实验条件求得的仍可比较IC50值只表明抑制作用大小，不表示拮抗剂的抑制性质；而双倒数作图法由曲线与纵横轴相交部位或不相交,即可判断拮抗剂的抑制性质,3.2.6 杂质污染放射配基对结合参数的影响,放射配基结合研究，通常能提供结合反应动力学参数，如受体密度，受体亲和性，结合反应的解离速率常数等等人们习惯的
19、思维是只要看到密度和亲和性的改变，就马上联想到它是否因为受体生理调节功能而造成的，很少会从杂质污染放射配基而带来的影响,3.2.6 杂质污染放射配基对结合参数的影响,假定:在单位点受体系统中,放射配基为L，结合浓度为L；未标记杂质为C，结合浓度为C；抑制剂为I，结合浓度为I。它们都属竞争性结合作用，杂质污染比率为F，图a,b为理论的饱和曲线和抑制曲线，曲线中的每一点按下述公式计算：（饱和曲线）（抑制曲线）式中 KL=1/Kd,K=1/Ki,杂质污染放射配基所作的理论饱和曲线(a)和抑制曲线(b),拟合动力学参数,杂质污染放射配基对结合参数的影响,从图a、b和上表资料可知：1.表观最大结合值（表
20、观Bmax）随杂质污染程度增加而减小2.放射配基表观Kd值随杂质污染程度增加而减小,亲和性变强3.抑制剂IC50值随杂质污染程度增加而增加,但是抑制剂的抑制常数Ki保持不变 4.杂质污染对结合反应的速率常数的影响关系比较复杂，纯放射配基的结合反应属于时间一级指数函数,实测结合速率常数(kobs)随放射配基浓度增加,呈线性增加关系,实测结合速率常数对放射配基浓度依赖关系,杂质对放射配基结合的影响取决于每个配基的相对解离速率当杂质的解离速率比放射配基快得多时，放射配基结合反应仍然是一级指数函数关系,但是实测结合速率常数不再是线性依赖放射配基浓度当杂质的解离速率常数接近放射配基时，实测速率常数值仍然
21、是不依赖于放射配基浓度，但是曲线也不再是一级指数函数当杂质的比率小于0.2时，实测结合速率常数(kobs)对放射配基浓度曲线呈线性或近乎线性，此时含杂质与不含杂质的表观Kd和最大结合率(Bmax)差别是难以区别的这些结果对放射配基结合分析带来影响，但也为实验结果的分析有更多的选择。如果实验所得的Kd和Bmax值比期望的要低，特别是实测的结合速率常数变成不依赖于放射配基浓度时，此时可考虑放射配基中是否存在未标记的竞争性杂质,3.3 受体与配基相互结合的二态模型,随受体结构、药理学及分子生物学知识不断更新和发现，经典的占领理论显得过于简单化,不能适应现代药理学的需要 近些年来受体领域中最引人关注的
22、概念是固有受体活性(constitutive receptor activation)和反向激动剂效应(inverse agonism)的发现，所以需要建立新的理论模型和实践加以解释和证明,受体活化的二态模型,借用Monod-Wyman-Chaneux酶的别构理论解释受体和配基结合后引起受体构象改变导致受体活化的机制,反应式,单态,二态,受体分子的构象,反应系统中天然受体允许存在两种状态受体,即非活化态受体(R)和活化态受体(R*)多数受体处于非活性态组成的静息态(quiescent or resting state)系统,少数受体处于活性态组成的是活性态(active state)系统 控制
23、这两种状态受体数量分布的常数称平衡常数(亦称别构常数)L。激动剂A对R的亲和常数(或解离平衡常数)是KA,激动剂A对R*的亲和常数是KA*,二态模型的数学表达,体系中的受体总量由4种形式组成：,活性受体的分数（fR*)为：,(27),根据方程（27），以fR*对激动剂A浓度作图,曲线中点相对应的配基浓度代表配基结合的表观亲和常数,如何估算受体的KA 和KA*值,曲线的最大值fmax：A,fA*=fmaxfmax=1/(1+L KA*/KA)曲线的最小值fmin：A0,fA*=fmin fmin=1/(1+L)表观亲和性：Kapp=KA*(1+L)/(1+L KA*/KA)因此 Kapp=KA*
24、fmax/fmin,如何估算受体的KA 和KA*值,由实验曲线求得曲线的最大值fmax和最小值fmin根据下列公式计算KA*=Kapp fmin/fmaxL=(1 fmin)/fminKA=KA*L fmax/(1 fmax),受体二态模型,激动剂的亲和性和效能之间有十分密切的关系，激动剂效应的强度直接取决于KA*/KA值激动剂按其性质可分为完全激动剂(full agonist)部分激动剂休止激动剂(silent agonist)部分反向激动剂完全反向激动剂（inverse agonist),受体二态模型,完全激动剂对活性态受体有优先亲和结合作用休止激动剂对非活性态和活性态受体有相同的亲和性反
25、向激动剂对非活性态受体有优先亲和结合作用,受体的固有活性(constitutive activity),一些天然受体在无激动剂的情况下,表现出相当高的生化反应行为如Na+的移动,此受体的活性称天然受体的固有活性 受体的固有活性是天然自发产生的,受体的固有活性,Lefkowitz实验室利用点突变方法将1B-AR胞内第三环Arg288,Lys290,Ala293分别换成Lys288,His290,Leu293,突变后的受体与拮抗剂的亲和性不变，但与去甲肾上素的亲和性及其引起的肌醇磷脂水解的效价和效能明显增强，即使在设有激动剂存在的情况下，在表达这些突变受体的细胞中肌醇磷脂水解的基础也显著增强。此后
26、他们又在突变的2-AR发现类似现象，突变体不仅与激动剂亲和性显著增高，而且在无激动剂存在时，2-AR的突变受体所偶联腺苷酸环化酶基础活性非常高，甚至达到完全激动剂作用于野生型的水平。,受体的固有活性,这些结果表明，野生型肾上腺素受体胞内第三环的固有结构与相应的G-蛋白有结合，引起胞内信号传递，产生生物学效应的功能。由于C-未端某些关键氨基酸残基与受体某部分结构相互作用，从而限制了这一功能的表现。当将这些关键氨基酸残基突变，受体自发变构使受体构象发生改变，从而解除这种限制作用，则其固有活性得以表现。此时的受体就是活性态受体，即使此时无激动剂存在情况下，受体仍表现出相当高的基础活性。,反向激动剂(
27、inverse agonist),在一些受体实验中发现：并不是所有的拮抗剂与受体结合后都不产生生物学效应，有一部分拮抗剂在一定条件下，可以产生与激动剂相反的效应1986年Ehlert在研究拮抗剂与苯二氮蕈受体结合后，在无激动剂存在时，产生与激动剂相反的效应1989年Costa等用拮抗剂ICI174864用于NG108细胞株能产生明显的抑制阿片受体所产生的GTP酶活性在2-AR-肾上腺素受体,2-肾上腺素受体,5-HT2C受体等均有类似现象。产生与激动剂相反效应的拮抗剂称为反向激动剂,反向激动剂,反向激动剂与非活性态受体亲和性高，使活性态和非活性态受体的平衡反应向非活性态受体方向移动，从而减少活性态受体数量，起到抑制生物学效应的作用,不可逆拮抗剂(Irreversible antagonist),竞争性拮抗剂：竞争性拮抗剂对活性态和非活性态受体具有相同的亲和性 不可逆拮抗剂:不可逆拮抗剂与受体结合,产生非竞争性作用,使受体不可逆的失活,a.正向激动剂随L值加大,取代曲线向右移动曲线形状变小,不可逆拮抗作用加大曲线的中点向右移动，Kapp值变大。,b.反向激动剂随L值加大,取代曲线向左移动曲线形状变小,不可逆拮抗作用减小曲线的中点向左移动,Kapp值变小。,不可逆拮抗剂对激动剂的取代反应,
