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1、一、基因工程的原理是什么?,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过_和_等技术，赋予生物以新的_，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,体外DNA重组,转基因,遗传特性,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程的概念,DNA 重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制（性核酸内切）酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从 的一种酶。识别双链DNA 分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。形成两种末端,原核生物中分
2、离纯化出来,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,粘性末端,平末端,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,连接黏性末端,Ecoli DNA连接酶,T4 DNA连接酶,磷酸二酯键,连接黏性末端和平末端,基因进入受体细胞的载体,通常有三种:作为载体的条件：在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在,质粒,噬菌体衍生物,动植物病毒,天然质粒,人工改造,的,能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离,基础上进行过,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、目的基因与运载体结合,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与表达,（基因表达载体的构
3、建）,（目的基因的检测与鉴定）,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,请阅读P9-11页,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,由于原核生物没有内含子(没有内含子剪接系统),动物和植物内含子的剪接系统不同,所
4、以不能相互剪接内含子,所以只能用没有内含子的cDNA。,连续,不连续,编码区,非编码,(二)利用PCR技术扩增目的基因,前提:已知目的基因的脱氧核苷酸序列方法：1.DNA受热（90-95OC）变性解旋为单链2.冷却后（55-60OC）DNA引物与单链相应互补序列结合、3.在适宜的温度下（70-75OC）热稳定DNA聚合酶（Taq 酶）作用下延伸合成互补链。,指数增长,归纳,72,94,55,PCR循环,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR反应,PCR
5、反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n
6、X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,利用PCR技术扩增目的基因,原理：在体外进行DNA复制,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,选修1 P60,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，
7、引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,三、人工合成,如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可 以通过DNA合成仪用化学方法之间合成！,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,目的基因+启动子+终止子+标记基因,目的基因的表达所需物质：,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露
8、出_。2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,(二)基因表达载体的构建,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,核心,同一种,(二)基因表达载体的构建,4.过程:,(三)将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进
9、入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）原理及适用范围,(三)将目的基因导入受体细胞,2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：,(三)将目的基因导入受体细胞,3、将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少（2）方法：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是
10、否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,巩固练习：1、有关基因工程叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成是在细胞内完成的 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2、下列关于酶的说法不正确的是（）A、限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C、不同的限制酶切割DNA的切点不同D、限制酶的作用主要是用来提取目的基因3、下列哪项不是基因工程中经常使用
11、的用来运载目的基因的载体（）A、细菌质粒 B、噬菌体 C、动植物病毒 D、细菌核区的DNA,D,D,A,D,4、下列说法正确的是（）A、DNA连接酶最初是从人体细胞中发现的 B、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 C、质粒是基因工程中唯一用作运载目的基因的运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”5、20世纪70年代，创立了一种新兴的生物技术基因工程，实施该工程的最终目的是（）A、定向提取生物体的DNA分子 B、定向地对DNA分子进行人工剪切 C、在生物体外对DNA分子进行改造 D、定向地改造生物的遗传性状,D,D,6、下列关于基因工程的叙述中错误的是（）
12、A、基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向改造生物，培育新品种 B、基因工程技术是唯一能冲破远缘杂交不亲和障碍，培育生物新类型的方法 C、基因工程的基本工具是：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和基因的运载体 D、基因工程的研究成果，目前大多需要通过发酵工程和酶工程来实现产业化7、在基因工程中，作为基因运输工具的运载体，下列特征除哪项外，都是运载体必须具备的条件（）A、能够在宿主细胞中复制，并稳定地保存 B、具有多个限制酶切点 C、必须是细菌的质粒或噬菌体 D、具有某些标记基因,B,C,1）以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C
13、、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制（）B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,
