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1、第一章 基本技术,实验室设置,基本技术,培养基及其配制,外植体接种培养,第一节 实 验 室 设 置,实验室组成,基本设备配置,培养容器与用具,细胞工程实验室的基本要求,实验室布局示意图,基 本 实 验 室,准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。,辅 助 实 验 室,细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究
2、。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,基本设备配置,基本设备,灭菌设备,光照培养室与设备,无菌操作设备,细胞学鉴定设备,天平，冰箱，酸度计，纯水器,活性成分过滤灭菌,接种工具随时消毒,培养基灭菌,玻璃器皿灭菌,培养容器与用具,玻璃容器塑料容器金属用具塑料用具,倒置显微镜,研究显微镜,激光共聚焦,第二节 细胞工程的基本技术,一、无菌操作技术二、细胞培养技术三、细胞融合技
3、术四、单克隆抗体技术,一、无菌操作技术,细胞工程的所有试验都要求再无菌条件下进行，要求十分严格的无菌操作。1、无菌室；2、超净工作台；3、生物材料的消毒；4、试验器械、器皿和药品的灭菌。,一、无菌操作技术,洗涤技术,灭菌技术,洗 涤 剂,合成洗涤剂,铬酸洗涤液,常用的铬酸洗涤液配方,玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿 新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗12次，干燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶 先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗12次。吸管、滴
4、管等内径狭小的玻璃制品 需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时左右，再用蒸馏水冲洗12次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。,塑料用品洗涤 一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较 强，因此冲洗时必须反复多次，最后用 蒸馏水冲洗。金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火 焰干燥。,培养基：湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌.玻璃器皿：湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热 至15040分钟，或
5、1202小时.金属器皿：干热灭菌.接种室：接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲 醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾,活性成分过滤灭菌,接种工具随时消毒,培养基灭菌,玻璃器皿灭菌,培养基体积与灭菌时间的关系,二、细胞培养技术,细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件的保存和生长。1、取材和除菌；2、配制培养基，对培养基进行灭菌；3、接种、培养和传代。,二、细胞培养技术,动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primary culture cell）继代培养细胞（sub-culture cell）细胞株（cell strain）正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line）亚二
6、倍体，接触抑制丧失植物细胞 类型：原生质体培养（体细胞培养）单倍体细胞培养（花药培养）非细胞体系（cell-free system）,动物细胞培养,原代培养(primary culture),原代培养是指从直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。,细胞株(cell strain),通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞称为细胞株。从培养代数来讲,可培养到40-50代。,Hela
7、细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,三、细胞融合技术,细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术单克隆抗体（monoclone antibody）技术（图1，图2）细胞拆合与显微操作技术物理法结合显微操作技术(图1、图2)化学法结合离心技术制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。其它技术 遗传分析（mutant,knock out,knock in）对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,三、细胞融合技术,两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合技
8、术的主要过程：1、制备原生质体；2、诱导细胞融合；3、筛选杂合细胞。,细胞融合,动物细胞融合（图1，图2)1962年,Okada和Tadokoro发现灭活 的仙台病毒有促使细胞融合的作用；聚乙二醇(polyethyl glycol,PEG),细胞融合,四、单克隆抗体技术,1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明,并获得1984年诺贝尔医学奖。它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术。原理:B淋巴细胞能够产生抗体,但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性,既能产生抗体,又能无限
9、增殖。,单克隆抗体技术,细胞拆合与显微操作技术,Knockout Mice,The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah.实验分三步 构建重组体；转基因敲除；筛选。,基因敲除,基因敲除示意图（1）,基因敲除示意图（2）,基因敲除原理,Knockout Mice,第三节 培养基及其配制,培养基基本成分培养基配方培养基配制,培养基基本成分,无机盐,无 机 盐 类,大量元素 培养基的大量元素使用量一般在每升
10、几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P,K、Ca、Mg、S微量元素 微量元素的用量一般低于10-510-7克分子浓度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co,有 机 成 分,糖 维生素 肌醇 氨基酸 其它,植 物 激 素,生长素,细胞分裂素,其 它,水,离体培养中，水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95。根据培养类型及其研究层次不同，可选择使用不同处理级别的水。如原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水，以免水中残留的离子造成培养基成分的变化而影响培养效果。如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净
11、水以降低生产成本，提高生产效益。实验室存放各类试验用水的容器应使用塑料制品，不能使用金属容器。存放容器应定期清洗，避免青苔和微生物滋生。玻璃容器亦不适于存放蒸馏水或纯净水，因为良好的透光性常常极易使青苔生长。,其它附加成分,琼脂活性炭附加复合成分,常用培养基配方,常用培养基配方：MS（Murashing and Skoog,1962）White（White,1934）B5(Gambor et al,1968)N6(朱至青，1974),培 养 基 配 制,大量元素配制成10-20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 培养用培养基按需要按比例加入,植物激素配制,植物激素一般配制成浓度为0
12、.11.0mg/ml的溶液，贮存在24下备用。由于多数激素难溶于水，一般按以下方法配制。IAA 先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。NAA 可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。2,4-D 先用少量1N的 NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。细胞分裂素类 KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1N的HCl溶解后再稀释至需要浓度。赤霉素 赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成510mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。,植物组织培养 植物组织培养是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温度、湿度）条件下，研究、
13、培养植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：1.预备阶段(外质体)；2.诱导去分化阶段；3.继代增殖阶段；4.生根成芽阶段；5.移栽成活阶段。,一般方法,移栽,经过锻炼的小苗，可以和一般植物一样进行大规模栽培,第四节 外植体接种培养,植物离体培养类型组织培养器官培养细胞培养原生质体培养,植物材料的培养与外植体选取外植体灭菌接种培养及培养条件的控制,外植体的来源,外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：一是生长在自然环境下的植物；二是有目的地培育在温室控制环境条件下生长的
14、植物；三是无菌环境下已经过离体培养的植物。,供体植株的管理,a.避免昆虫为害。b.注意防病。c.正确浇水。d.控制环境湿度。e.取材前应尽可能保持供体植株干爽。,外植体取材,a.根据培养需求选择植物部位b.多年生植物注意树龄和季节c.在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体,预备阶段,(1).选择合适的外植体；外植体的部位、年龄及大小。(2).除去病原菌及杂菌；对外植体除菌的一般程序如下：外植体 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 无菌滤纸吸干(3).配制适宜的培养基。包括以下三大类组分：a.含量丰富的基本 成分；b.微量无机物；c.微量有机物。,外 植 体 灭 菌,不同
15、外植体在灭菌剂浓度、时间、程序上应有所区别,几种常用消毒剂的效果比较,接种培养及培养条件的控制,外植体灭菌后应及时接种培养,培养条件控制,光照,温度,pH,气体,光照包括：时间、强度和光质；光照时间影响植株再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质研究报道较少,引自Pierik,1987,在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。,温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响,通常使用的pH值范围是5.56.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化高压灭菌引起pH 变化,
