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1、实验一 生化实验认知,一、实验室简介二、实验室常用仪器使用三、实验室安全防护四、生化实验考核办法五、清点器材,一、实验室简介,生化实验室为上海交大生农医药大平台生物化学实验室，目前承担生命科学与技术学院、医学院、药学院、农业与生物技术学院等学院本科生生物化学实验教学任务，实验教学时数达3.5万人学时数。生化本实验室拥有凝胶成像分析系统、蛋白质表达、纯化和鉴定系统、紫外分析仪、PCR仪、恒温培养箱、超声波细胞粉碎机、高速台式离心机、低温冰箱、超净工作台、超纯水机等，可同时容纳90名学生参加实验。,实验室现有人员4人、其中教授1人、副教授2人、实验室专职人员1人。,1.务必于規定時间內到达实验室。
2、2.务必穿实验衣。3.严禁在实验室吃东西4.离开实验室时，务必将所有物品归位，桌面保持干净。5.废液请倒入收集桶内。,本实验室需要提醒学生的实验室规则：,二、实验室常用仪器使用,1、离心机2、分光光度计3、计量仪器,1、离心机,在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，有过滤和离心两种方法。在下述情况下，使用离心方法较为合适。a.沉淀有粘性；b.沉淀颗粒小，容易透过滤纸；c.沉淀量多而疏散；d.沉淀量少，需要定量测定；e.母液量很少，分离时应减少损失；f.沉淀和母液必须迅速分离开；g.母液粘稠；h.一般胶体溶液；,使用方法1）使用前应先检查变速旋钮是否在“O”处。2）离心时先将待离心的物质转移到大小合
3、适的离 心管内，盛量占管的2/3体积，以免溢出。将 此离心管放入外套管内。3）将一对外套管（连同离心管）放在台秤上平衡，如不平衡，可用小吸管调整离心管内容物的量 或向离心管与外套间加入平衡用水。每次离心 操作，都必须严格遵守平衡要求，否则将会损 坏离心机部件，甚至造成严重事故，应十分警 惕。4）将以上两个平衡好的套管，按对称位置放到离 心机中，盖严离心机盖，并把不用的离心套管 取出。,5）开动时，先开电门，然后慢慢拨动变速 旋钮，使速度逐渐加快。停止时，先 将旋钮拨到“O”，不继续使用时，拔下 插头。待离心机自动停止后，才能打开 离心机盖并取出样品，绝对不能用手阻 止离心机转动。6）用完后，将
4、套管中的橡皮垫洗净，保管 好。冲洗外套管，倒立放置使其干 燥。,2、分光光度计,分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。分光光度计的简单原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。,使用方法 1）用波长设置键，设置所需的分析波长。2）将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打 开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位 中。仪器所
5、附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测试精度。比色皿 透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能 有气泡、悬浮物，否则也将影响样品测试的精度。3）将参比样品推（拉）入光路中，按键调 100%T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“100.0”为止。4）当仪器显示器显示出“100.0”后，将被测样品推（拉）入光路，这时便可从显示器上得到被测样品的透射比或 吸光度值。,核酸的定量 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数
6、不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。光度计测量的转换:双链DNA(ds DNA)：A260=OD260=1 相当于50 g/ml溶液单链DNA(ss DNA)：A260=OD260=1相当于33 g/ml溶液RNA：A260=OD260=1相当于40 g/ml溶液测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。,除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影
7、响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。,蛋白质的直接定量（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。,注意事项 为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求A280吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。这即意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
8、此外，混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。,细菌细胞密度（OD 600）实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞
9、计数，做出校正曲线。,3、水浴的使用,4、滤纸的使用,5、清洗仪器,6、计量仪器,计量仪器的选择的原则：应根据量取液体的体积大小而定，同时要考虑量取的准确度。,移液管的使用,移液枪由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液枪吸头有所不同，实验室常用的移液枪根据最大吸用量有2ul,10ul,20ul,200ul,1mL等规格。,移液枪的使用,使用方法 1.根据实验精度选用正确量程的移液枪。2.移液枪的吸量体积调节：移液枪调整时，切勿超过 最大或最小量程。3.吸量：将一次性枪头套在移液枪的吸杆上，有必要 时可用手辅助套紧，但要防止由此可能带来的污染；然后将吸量按至第一挡（first s
10、top），将吸嘴垂直 插入待取液体中，深度刚浸没吸头尖端为宜，然后 慢慢释放吸量按钮以吸取液体；释放所吸液体时，先将枪头垂直接触在受液容器壁上，慢慢按压吸 量按钮至第一挡，停留12秒后，按至第二档second stop）以排出所有液体。,注意事项1.吸头的更换：性能优良的移液器具有卸载吸头的机械装置，轻轻按卸载按钮，吸头就会自动脱落。2.在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不 用时置移液器于架上；3.吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上 部；,倾倒液体样品,倾倒固体样品,二、实验室安全防护,1.了解化学药品的警告标志(如图1.1所示)。2.实验操作过程中凡遇到有能
11、产生烟雾、有毒性或腐蚀性气体时，应在通风橱中进行。2.使用毒性物质和致癌物质必须根据试剂瓶上标签说明严格操作，安全称量、转移和保管。操作时应戴手套，必要时戴口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。沾过毒性、致癌物的容器应单独清洗、处理。3废液，特别是强酸和强碱不能直接倒在水槽中，应先稀释，然后倒入水槽，再用大量自来水冲洗水槽及下水道。,几种有代表性的危险化学药品的防护措施,如酚触及皮肤引起灼伤，可用酒精洗涤。酸、碱等化学试剂溅入眼内，先用自来水或蒸馏水冲洗眼部，如溅入酸类物质则可再用5碳酸氢钠溶液仔细冲洗；如溅入碱类物质，可以用2硼酸溶液冲洗，然后滴入1至2滴油性护眼液起滋润保护作用。,四、生化实验考核办法,平时训练占45%作业与创新能力占45%出勤、卫生、安全占10%,谢谢大家配合!,
