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1、第八章 基因工程寄生虫疫苗 Parasite Vaccine By Gene Engineering第一节 概 述（Section I Outline）人体寄生虫与人类共存的历史可追溯到远古，在漫长的岁月里寄生虫和宿主的关系经历了“史前期”，“形成期”和“确定期”。据WHO统计，目前大约1/4世界人口受到五大寄生虫感染（疟疾、血吸虫、利什曼原虫、丝虫、锥虫）要全面控制寄生虫病的流行，所面临的仍是一条漫长而艰辛之路。,寄生虫与宿主的关系保持平衡是在长期进化过程中逐步形成的。经过自然选择宿主逐渐形成有效的免疫反应以防范寄生虫的毒害作用。通过高度自然选择，一些种群的寄生虫和宿主关系不相适应，难以平衡
2、逐步消失。而另一些种群在进化过程中获得某些保护自己而不被宿主清除的功能，即所谓寄生虫的免疫逃避机制。,一、对寄生虫疫苗研究成功的关键（key of success）1、包括选择免疫应答难以作用的寄生部位；2、寄生虫在宿主体内不同发育阶段表现抗原特异性改变，从而使获得性免疫力有严格的阶段（或期）特异性。各阶段（期）因其不同的表面抗原而避开了前一阶段引起的宿主免疫效应机制的伤害。寄生虫表面抗原变异在锥虫，疟原虫，巴贝虫等致病性原虫表现更为明显。,3、寄生虫在抗原变异，抗原摹拟和寄生虫摄入宿主DNA和获得宿主蛋白或以宿主抗原伪装自己方面也表现出非常复杂而有效的免疫逃避机制。但是，任何一种寄生虫在宿主
3、体内长期存活的免疫逃避机制均未能完全搞清楚。仍是一个值得深入研究和探讨的课题。,二、寄生虫疫苗的分类（category of parasite vaccine）寄生虫疫苗研究始于1903年，至今洽好100年。可分类为：带低毒活野生型疫苗（自然界中分离的）；致弱病原疫苗（减毒活疫苗）；灭活或死病原疫苗；亚单位疫苗（包括抽提物或代谢产物）；合成的或重组的抗原疫苗；抗独特型Ab疫苗；DNA疫苗。,三、问题（questions）迄今仍无公认的寄生虫病疫苗，究其原因：（1）多数寄生虫为多细胞生物，寄生虫抗原成分非常复杂，很难找准特定保护性抗原，保护性免疫应答机制不清。（2）寄生虫抗原免疫所诱导的大都为部
4、分保护性免疫力（一般为30%70%）。（3）寄生虫形成种种逃避宿主免疫应答的办法，其机制尚待阐明。（4）寄生虫一般引起慢性长期感染，病期因寄生虫生活史中形态上不同，常存在数阶段（期）。,第二节 基因工程寄生虫疫苗的研究现状（Research status of parasite vaccine by gene engineering）一、疟疾疫苗(maria vaccine)世界上每年3-5亿人口感染人疟，1.5-3百万人死于疟疾。大多数严重发病和死亡发生在儿童和孕妇，主要是恶性疟（由恶性疟原虫感染引起）。,(一)疟疾及疟原虫,疟疾（Malaria），又名打摆子，经按蚊叮咬而感染疟原虫所引起的
5、虫媒传染病。,9,全球疟疾疫情分布图,全球人口的35%(约23.7亿人)存在患疟疾的风险。而这一数据比起以往有所下降。研究人员还指出，目前全球有大约10亿人口居住在疟疾高风险地区，而非洲以外的感染率低于5%，撒哈拉以南的非洲地区是目前疟疾感染最严重的地方。,10,疟疾的危害,疟疾仍然是当今人类的最大杀手之一，每年疟疾发病人数为35亿，因恶性疟引起死亡超过100万。,11,疟疾的主要症状,周期性寒战发热头痛出汗贫血脾肿大,12,间日疟原虫生活史与形态,人（脊椎动物宿主）,蚊（媒介宿主）,肝细胞内发育,红细胞内发育,胃内配子生殖,胃壁孢子生殖,间日疟原虫生活史与形态,人体内发育阶段红细胞外期（肝细
6、胞内发育）,TS子孢子（蚊）BS,红外期裂殖体,休眠子,红外期裂殖子,子孢子 红外期裂殖体 裂殖子（蚊）（肝细胞）,间日疟原虫生活史与形态,人体内发育阶段红细胞内期（红细胞内发育）,红外期裂殖子侵入红细胞进行无性的裂体增殖循环和有性体形成 环状体(ring form)大滋养体(trophozoite)裂殖体(schizont)红内期裂殖子(merozoite)配子体(雌、雄)(gametocyte),间日疟原虫生活史与形态,蚊体内发育阶段配子生殖(胃腔内)孢子生殖(胃壁上),雄配子体,雌配子体,雄配子,雌配子,合子,合子,动合子,囊合子(卵囊),子孢子,子孢子(唾腺),疟原虫的生活史（图）,雌
7、雄配子体,雌雄配子,动合子 合子,囊合子,子孢子母细胞,感染性子孢子,蚊体内,人体内,迟发性,速发性,复发,急性发作,预 防,2005年6月30日，美国总统布什说：“疟疾（malaria）问题是非常悲剧性的，因为该疾病本身是高度可治、可防的。,盖茨向疟疾开战,控制传染源 切断传染途径 保护易感人群,1亿美元 研制几种抗疟疾新药5070万美元 对杀虫剂和灭杀蚊子的手段进行改进1.076亿美元：葛兰素史克公司，用于研制一种抗疟疾疫苗，最早2010年上市,盖茨基金会2006年12月12日宣布，将再提供8350万美元用于疟疾的防治。世界银行发起一项全球抗击疟疾计划，准备动用5亿至10亿美元资金帮助非洲
8、国家抗击疟疾。,（二）疟疾疫苗的分类,1.抗红前期原虫疫苗 红前期疟疾疫苗又称抗感染疫苗，主要针对疟原虫子孢子或肝内期疟原虫，红前期疫苗通过诱导机体产生特异性抗体，来阻止子孢子入侵肝细胞或诱导机体产生特异性识别感染肝细胞的 T细胞，来杀死感染肝细胞或干扰疟原虫在肝细胞内的发育增殖，阻止其释放出感染性裂殖子，从而达到抗感染的效果。抗红前期原虫疫苗达到100%的保护率才能真正达到保护效果,因为只要有单个子孢子逃逸就可能引起机体的感染。,位于子孢子表面的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein，CSP)和血凝素相关匿名蛋白(thrombospondin related anon
9、ymous protein，TRAP)是针对该期原虫的2个重要的疫苗候选抗原。目前研究较为深入的红前期疫苗是GSK（GlaxoSmithKline，GSK）生物公司和美国陆军医学研究院合作开发的RTS,S ASO1/AS02疫苗。RTS，S疫苗是全球第一种早期疗效显著，它由 2 部分组成,即 CSP的 19 个 NANP重复序列及其 C未端序列与乙肝表面抗原融合而成,2 抗红内期原虫疫苗 红内期疟疾疫苗又称抗病疫苗，其机制一般是阻断裂殖体入侵红细胞或避免感染红细胞黏附于血管内皮细胞。裂殖子表面蛋白和顶端复合体抗原成为疫苗研究的焦点，多种抗原被作为候选疫苗进行研究。目前有些疫苗已进人临床试验并取
10、得阶段性成果，单一抗原疫苗MSP-1、AMAl、GLURP、SERA、ISA720及多抗原疫苗GMZ2、PfCP-2.9/ISA720,3 传播阻断性疫苗 通过阻止疟原虫在蚊虫体内的有性增殖而达到阻断疟疾传播的目的，在这个过程中，虽然不能使个体免于疟疾感染，也不能减轻症状，但能阻断蚊虫将疟原虫从一个宿主传播至另一个宿主，传播阻断性疫苗候选抗原主要表达于蚊虫阶段疟原虫表面，是当前疟疾疫苗研究的热点。雌雄配子、合子和动合子所表达的表面蛋白是研制传播阻断性疫苗的重要靶抗原。,（三）疟疾疫苗研制的3个阶段,1.第一阶段是减毒疫苗2.第二阶段是亚单位疫苗3.第三阶段是基因疫苗,（四）疟疾基因疫苗,1.孢
11、子体表面蛋白2基因疫苗ssP22.环子孢子蛋白基因疫苗CSP（体液免疫）3.疟原虫蛋白17基因疫苗HEP17(肝细胞空泡膜，红细胞膜)（CTL反应）4.HEP17/CSP联合基因疫苗,5.裂殖子主要表面蛋白基因疫苗AWA1、AWA2、Pf55/RESAMSP16.有性期抗原基因疫苗Pfs230、48/45、27、25、28,疟疾疫苗研制所面临的困难和挑战,(1)缺乏保护作用强的候选抗原。尽管在过去25年中已鉴定了约40 个疫苗候选抗原,但能产生强而持久保护性免疫力的抗原仍十分有限;(2)缺乏对疟疾保护性免疫机制的了解,疟原虫生活史复杂、抗原具有期特异性并存在高度变异、疟原虫具有多种入侵途径和逃
12、避宿主免疫攻击的机制;(3)缺乏有效的动物模型。由于疟原虫抗原序列存在种间差异,因此无法用动物疟原虫模型来评价人体疟疾疫苗;(4)缺乏持久的免疫力和难以产生足够高水平的抗体。,绿水青山枉自多华佗无奈小虫何千村薜荔人遗矢万户萧疏鬼唱歌,送瘟神 毛泽东,（一）血吸虫病裂体吸虫,血吸虫由于寄生在人体的血管内而得名；它引起的血吸虫病俗称大肚子病；,血吸虫对人类的危害 1.分布广 2.后果严重,二、血吸虫疫苗,全球血吸虫分布图,分布,后果严重,寄生于人体的血吸虫（6种）埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）1851曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）1902日本血吸
13、虫（Schistosoma japonicum）1903间插血吸虫（Schistosoma intercalatum）1934湄公血吸虫（Schistosoma mekongi）1978马来血吸虫（Schistosoma malayensis）1988,日本血吸虫Schistosoma japonicum,S.j,成虫主要寄生于肠系膜下静脉，致病以虫卵为主，可引起严重的血吸虫病。,血吸虫的主要特点,成虫似线虫，圆柱形；雌雄异体，但常合抱成虫在血管内（门脉系统）寄生，虫卵从粪或尿中排出生活史中无雷蚴和囊蚴阶段尾蚴为感染期，经皮肤感染仅有一个中间宿主：钉螺虫卵无盖，虫卵是主要致病因素，危害严重,日
14、本血吸虫生活史简图,人体内阶段,人体外阶段,日本血吸虫生活史宿主,中间宿主,钉螺是血吸虫的唯一中间宿主。,日本血吸虫生活史宿主,中间宿主,保虫宿主,牛、羊、猪、狗、鼠等30多种哺乳动物。,终宿主,水牛,1.感染条件：,接触“疫水”,日本血吸虫生活史尾蚴感染,2.感染方式：,尾蚴主动钻入皮肤,尾蚴性皮炎,日本血吸虫生活史尾蚴感染,1.感染条件：,日本血吸虫致病性,尾蚴童虫成虫虫卵,致病机理*,（分泌物）尾蚴性皮炎,（机械性损伤）肺炎,（夺取营养）营养不良（机械性刺激）血管内膜炎,（虫卵肉芽肿）肝、肠纤维化,CAg,（形成CIC）血吸虫病肾病、关节炎,*,肝.肠纤维化,日本血吸虫致病性,虫卵结节阻
15、塞窦前静脉,回心血流受阻,门脉高压,腹水,大肚子病,1.虫源性疫苗 死疫苗/减毒活疫苗2.基因工程疫苗3.DNA疫苗4.合成多肽抗原疫苗5.抗独特型抗体疫苗Ab1 Ab2 抗Ab2 cocktail,（二）.血吸虫疫苗分类,WHO/TDR选择的6种血吸虫病侯选疫苗抗原：谷光甘肽S转移酶（GST）副肌球蛋白（Sm97）照射减毒抗原5（IrV-5）磷酸丙糖异构酶（TPI）完整表膜蛋白（Sm23）脂肪酸结合蛋白（Sm14）,（三）.血吸虫基因疫苗,（四）存在的问题,1.血吸虫存在免疫逃避机制2.在动物模型和人体内的免疫机制差异3.免疫效应机制的选择诱导4.抗原表位的鉴定5.糖基表位6.保护水平7.超
16、敏反应8.佐剂,抗原伪装 抗体封闭 分泌CAg 免疫耐受,第三节 基因工程寄生虫疫苗研制 的前景及展望（foreground and prospect）特定寄生虫疫苗的成功研制依赖于对寄生虫感染时所引起免疫应答的细胞和体液成分清楚的了解，以及对能诱导保护性应答抗原的确定。最近在验证和生产某些寄生虫病疫苗潜在保护性抗原方面取得明显进展，但对免疫宿主所诱导保护性免疫力的机制了解以及人对寄生虫病免疫应答特征的研究进展不大。,1998年WHO/TDR与美国NIH/USAID密切协作资助血吸虫疫苗研制计划（SVDP）主要是促进对两个重组曼氏血吸虫抗原副肌球蛋白和MAP4/TPI的I期临床试验以及另两个候
17、选抗原IrV-5和MAP-3（Sm23）的DNA疫苗实验研究，以期找到安全有效的血吸虫疫苗。SVDP将血吸虫疫苗候选抗原研究集中在重组抗原和DNA疫苗的评价上。,从全球看，对寄生虫疫苗新候选抗原的发现，研制和临床试验需要各国共同协作，特别是发达国家科学家和寄生虫病流行国家的科研机构间的协作。,对疟疾，利什曼病和血吸虫病，一种重组抗原的混合疫苗可能克服遗传局限性和株种特异性。作为多抗原表位基因途径，已用重组形式同时表达在一种致弱痘苗病毒细胞称NY VACpf7。第一次试验已完成。此外，核酸疫苗（含编码不同肽基因）也有价值。有效的佐剂可能增强抗原诱导保护作用，对抗原提呈细胞提供上调共同刺激因子所必须的信号，以及诱导分子的表达从而使这些细胞达到靶组织。,用于疫苗注射的任何分子必须能诱导保护性免疫力，同时并不引起免疫病理或免疫抑制反应。至今仍无现成的疫苗预防人寄生虫感染，人们仍将注意力集中在新药研究及对寄生虫病治疗上。一些研究者认为核酸将成为未来寄生虫病的疫苗。,表7-1 曼氏血吸虫疫苗候选抗原,
