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1、1,实验二 蛋白质等电点及含量测定,1台可见光分光光度计配套4个玻璃比色杯，用完务必立即洗净、晾干。切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。实验结束后，务必将使用过的玻璃器皿洗净、晾干、放回原处。,【温馨提示】,P40/P51,2,学习蛋白质的两性解离性质，掌握pH值法测定蛋白质等电点的一般原理和操作方法。学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。,【实验目的】,01,蛋白质等电点的测定,4,【实验原理】pH值沉淀法测定蛋白质等电点,蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：,5,蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且
2、分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7-4.8。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。,【实验原理】pH值沉淀法测定蛋白质等电点,6,实验仪器4支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（200uL）等。实验材料和试剂蒸馏水、1M醋酸、0.1M醋酸、0.01M醋酸、酪蛋白溶液。,【仪器试剂耗材】pH值沉淀法测定蛋白质等电点,7,【操作步骤】pH值沉淀法测定蛋白质等电点,每小组取4支15mL玻璃试管，按下表顺序分别精确地
3、加入各试剂，加入后立即混匀，加一管，摇匀一管。,静置，观察各管在不同时间的混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。观察时可用+，+，+，表示浑浊度。,8,【实验结果与分析】pH值沉淀法测定蛋白质等电点,观察各管中清澈度变化，记录结果（用+，+，+，表示浑浊度）并解释现象。确定酪蛋白的等电点。,蛋白质在等电点沉淀的原因是什么？影响该实验结果准确性的因素有哪些？,【思考题】,02,蛋白质含量的测定,双缩脲法测定蛋白质含量,11,【实验原理】双缩脲法测定蛋白质含量,双缩脲（NH3CONHCONH3）是两分子尿素经180左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲能与Cu 形成紫红
4、色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，可发生双缩脲反应。,2+,12,【实验原理】双缩脲法测定蛋白质含量,紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，颜色深浅可在540 nm比色测定，故可用此法来测定蛋白质含量。测定的蛋白质浓度范围为1-10 mg/mL。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。,13,实验仪器6支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪
5、（200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。（绘制标准曲线）2支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪（200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。（样品测定）实验材料和试剂双缩脲试剂、标准牛血清蛋白、蒸馏水、待测样品（可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白）。,【仪器试剂耗材】双缩脲法测定蛋白质含量,14,【操作步骤】双缩脲法测定蛋白质含量,1.标准曲线的绘制。（全班绘制1份即可）取6支15mL试管，编号0-5，按下表顺序加入各试剂。,15,【操作步骤】双缩脲法测定蛋白质含量,上述试剂加完后，充分混匀，室温放置30 min。以0号管为对照管，于540 nm处比色测
6、定吸光值，记下各管吸光度。以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，作吸光度-蛋白质含量标准曲线。（见电脑桌面Excel表格“标准曲线绘制”）,16,【操作步骤】双缩脲法测定蛋白质含量,2.蛋白质样品测定（每小组做1份）1.另取2支试管，分别加1 mL未知浓度的酪蛋白蛋白质样品液（注意样品浓度不要超过10 mg/mL），加1 mL蒸馏水，加4 mL双缩脲试剂，混匀，室温放置30 min。2.2支样品溶液于540nm处比色测定吸光值。3.取两组样品测定的吸光值平均值，根据回归方程计算出相应蛋白质的 浓度。4.按下列公式计算出样品蛋白质的含量：,样品蛋白质含量（mg/100 mL）=YN100
7、/V,式中，Y为标准曲线查得的蛋白质的量（mg），N为稀释倍数，V为样品所取的体积（mL）。,y=0.042x-0.0004,17,【实验结果与分析】双缩脲法测定蛋白质含量,样品蛋白质含量（mg/100 mL）=YN100/V,2.计算样品蛋白质的含量,式中，Y为标准曲线查得的蛋白质的量（mg），N为稀释倍数，V为样品所取的体积（mL）。,1.绘制蛋白质标准曲线,18,【思考题】,影响标准曲线的因素有哪些？,蛋白质含量测定中需要注意什么问题？,19,【注意事项】,等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须非常准确。标准曲线选择不能只看R，还应该看曲线斜率和截距。R 大小与实验操作和仪器都有关系。显色时间过长，可能会出现雾状沉淀，影响比色。（解决方法：尽快比色）脂肪性物质会影响反应。（可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上澄清液再测）测定样品管吸光度时，其吸光值应界于标准曲线范围内，如超出，应适当稀释样品后再测。,2,2,
