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1、1,第十二章 层析技术,2,层析技术（chromatography）又称色谱技术、层离技术等，是一组相关技术的总称。层析技术具有分离精度高、设备简单、操作方便等优点，是当前获得高纯度产物最有效的分离纯化技术。根据使用目的不同，层析技术分为制备层析技术和分析层析技术。,3,主要内容,第一节 概述第二节 吸附层析技术第三节 凝胶层析技术第四节 离子交换层析技术第五节 亲和层析技术,4,当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂对各组分的阻滞力不同而使各组分分离开来（不同组分在流动相和固定相分配不同）。,第一节 概 述,一、基本原理,（a）层析系统基本组成,（b）分离出组分峰图,5,二、层析技术
2、分类,按流动相-固定相分气-液色谱（GLC）气-固色谱（GSC）液-液色谱（LLC）液-固色谱（LSC）按固定相不同分柱色谱纸色谱薄层色谱,按分离机理不同分吸附色谱离子交换色谱凝胶色谱亲和层析疏水层析,6,三、层析操作过程中一些基本概念和参数,料液(各组分)层析柱分离随流动相依次流出进入检测器响应信号 色谱图的纵坐标为检测器的响应信号，横坐标为时间或流动相流出体积。,1.色谱流出曲线(色谱图),7,色谱图,8,2.体积、时间,总柱床体积（Vt）：层析剂经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层柱内的总体积。外水体积（Vo）：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积的总和。内水体积（Vi）：溶胀后的层析剂颗粒网
3、孔中的液相体积的总和。基质体积（Vg）：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨架所占据的体积。,Vt=Vo十ViVg,9,洗脱时间(或保留时间)(te)：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗脱峰最高点)时的时间。,洗脱体积(Ve)：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值(洗脱峰最高点)时的流动相体积。,10,死体积(Vm)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积。其值等于外水体积加内水体积。死时间(tm)：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等于流动相流过层析
4、柱所需的时间。调整保留时间(te tm)：保留时间扣除死时间的值。,11,峰高(h):色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。峰宽(W)和半峰宽(W1/2):峰宽是通过色谱峰的拐点作切线在峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。峰面积(A):峰与峰底之间的面积称为峰面积。,3.峰高、峰面积和峰宽,12,分离度(R)又称分辨率，是相邻两个洗脱峰保留时间之差的2倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：,R1时，两峰部分重叠；R=1时，两峰有98%的分离；R=1.5时，两峰分离程度可达99.7%。因此，一般用R=1.5作为两种组分完全分离的标志。,4.层析柱的分离度,式中：te2 和te1洗脱峰2
5、和峰1的保留时间；W1 和W2 洗脱峰1和峰2的峰宽。,13,它们之间的换算关系为：体积流速（mL/mim）=线性流速（cm/h）层析柱截面积（cm2）/60。,5.流速的表示法,在放大过程中应保持线性流速不变；而增加体积流速将随层析柱截面积的增大而增加。,流速有线性流速(cm/h)和体积流速(mL/min)。,14,6.柱效,柱效是表达层析柱性能的重要参数，可用理论塔板数N和理论塔板高度H来衡量。,N=5.54(te/W1/2)2,H=L/N,理论塔板数越大或理论塔板高度越小，说明层析柱分离效率越高。,15,四、柱层析系统的基本组成及基本操作,层析柱+层析剂上样洗脱系统检测系统收集系统,1.
6、柱层析系统的基本组成,16,层析剂选择和预处理装柱平衡上样洗脱检测收集层析剂再生和保存,2.柱层析的基本操作,17,第二节 吸附层析技术,以吸附剂为固定相，根据待分离组分与吸附剂之间的物理或化学吸附力差别而达到分离目的的层析技术。,一、基本原理,吸附力:物理吸附(范德华力)：吸附存在于整个自由界面；可逆的；无严格选择性化学吸附：稳定；选择性强,优点：容易保持组分活性，操作简单缺点：吸附容量小，选择性差，无机吸附剂性能不稳定,固定相：多孔、颗粒状的固体吸附剂,18,（一）无机吸附剂,二、生物分离过程中常用的吸附剂,极性吸附剂吸附时：从非极性溶剂中吸附极性溶质洗脱时：用极性溶剂洗脱,硅胶、氧化铝、
7、羟基磷灰石,19,硅胶作吸附层析剂，还可作为其他层析剂的基质在碱性水溶液中不稳定，应用的常规pH为2-8活性硅胶为多孔的，吸附作用与本身含水量有关硅胶的活化、再生可分离氨基酸衍生物、甾体激素、皂苷类、类脂及色素等氧化铝常用的亲水性吸附剂，较高吸附容量，分离效果好，尤其适用于亲脂性成分的分离吸附活性与含水量相关羟基磷灰石吸附容量高，稳定性好，可制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒等,20,（二）有机吸附剂：活性炭,非极性吸附剂吸附时：从极性溶剂中吸附非极性溶质洗脱时：用非极性溶剂洗脱应用范围：脱色、去有机杂质、热源等再生：水洗5%NaOH洗酸洗中和水洗160加热干燥4-5h,21,特点：孔隙大小、骨
8、架结构、极性可按需要选取分类：分为极性、非极性和中等极性三类优点：选择性好、机械强度高、可反复使用范围：使用范围广，特别适合有机物分离厂家：美国Rohm and Haas公司生产的Amberlite XAD系列；日本三菱公司的Diaion HP系列,（三）大网格聚合物吸附剂（大孔树脂）,22,第三节 凝胶层析技术,又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤法等。,根据分子大小进行分离纯化的方法,不同大小的分子流过多孔凝胶分子大的组分先流出，分子小的组分后流出各组分便按分子从大到小的顺序依次流出,一、凝胶层析的基本原理,23,Vt=Vo+Vi+Vg,Vt:凝胶柱床体积Vi：内水体积Vo：外水体积V
9、g：干胶体积,Ve=Vo+Kd Vi,Ve:洗脱体积 Kd：分配系数,24,二、常用凝胶层析剂,葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶，以及各凝胶的改性物。,Sephadex G系列、Sephacryl S 系列和Sephadex LH系列。,(一）葡聚糖系列,由天然高分子葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。国外商品名为Sephadex。,主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有三类：,25,工作pH范围2-13；可以耐110（湿胶）消毒。含有少量羧基；离子强度0.02M，吸附已微弱。不耐压。,1.Sephadex G 凝胶,葡聚糖与3-氯-1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成。,
10、交联度：如Sephadex G25,G50,G100,数字越小，交联度越大，凝胶网状结构越紧密。吸水量与数字关系：如G25，表示吸水量为1g干胶吸水2.5g.,凝胶型号与交联度、吸水量的关系：,26,G-25和G-50中分别引入羟丙基，形成烷基化葡聚糖凝胶主要型号为Sephadex LH-20和LH-60适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质,2.Sephadex,3.Sephacryl S 系列,葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。分离范围远远大于Sephadex的范围。化学稳定性更高。机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高。,27,1.Bio-Gel A系列 型号有0.5
11、m、1.5m、5m、15m、50m、150m。其中的琼脂糖含量为10%、8%、6%、4%、2%、1%。2.Sepharose 系列 包括Sepharose2B、4B、6B，数字代表琼脂糖浓度。3.Separose CL 利用2，3-二溴丙醇作交联剂得到Sepharose CL 2B、4B、6B。稳定性和机械强度都有所提高，能耐高温消毒。,（二）琼脂糖凝胶,由经过纯化的琼脂糖制备。主要包括：Bio-Rad 公司的Bio-Gel A系列 Pharmacia 生产的Sepharose系列及其改性系列,28,4.Sepharose Fast Flow5.Superose系列 经过二次交联制备的刚性琼脂
12、糖凝胶6.Superdex 系列 将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖珠体上制备的刚性凝胶,29,聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad 生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 P-300等10种。后面的数字乘以1000就基本代表它们的排阻极限。,（三）聚丙烯酰胺凝胶,丙烯酰胺与N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。改变亚甲基双丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。,聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。pH为211之间比较稳定。非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小。不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。,性质：,30,三、表征凝胶
13、性能的几个参数,1、排阻极限和渗入限(分级范围）：分子量进入上限和下限2、吸水量：指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量 3、凝胶颗粒大小：一般较常用的是40200m 4、溶胀度：凝胶吸水后体积，也叫膨胀体积5、pH范围6、耐受压力范围7、最高流速,31,四、凝胶柱层析的操作,层析剂选择和预处理装柱平衡上样洗脱检测收集层析剂再生和保存,32,根据样品确定分离范围，从而选择合适型号的凝胶应将大分子完全排阻而小分子完全渗透。适当的颗粒度：颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。,1、凝胶选择,2、凝胶的处理,估算用量：首先要根据
14、选择的层析柱估算出凝胶的用量。溶胀：在10倍以上的水中（或洗脱剂）充分溶胀倾泻法去悬浮物小颗粒减压排气,3、层析柱的选择,层析柱的直径和长度比一般在1:251:100之间。,33,将柱子洗涤干净安装柱并调垂直关闭层析柱出水口，并加入少量洗脱液检漏及排气泡将处理好的填料缓慢装入柱中，同时打开出水口，控制适当流速使填料等均匀沉降，并不断加入填料溶液使柱中填料表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液，同时关闭出水口,4、装柱,34,柱子装好后，要用所需洗脱液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平
15、衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。,加样体积应低于5%的床体积。加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。,5、平衡,6、加样,35,凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02的叠氮化钠（也可置于乙醇溶液中），4左右保存。,7、检测、收集,应注意洗脱时的速率和压力。,6、洗脱,检测器检测。按时间、体积收集，或按检测曲线收集。,8、凝胶的保存,36,1.生物大分子的纯化2.分子量测定 3.脱盐及去除小分子杂质,五、凝胶层析的应用,37,第四节
16、 离子交换层析技术,离子交换剂不溶于水的带有电荷基团的惰性高分子聚合物。包括三部分：,一、基本原理,依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。,交换反应：活性离子与溶液中其它的离子基团发生可逆的 阳离子交换剂活性离子带正电的与带正电的离子基团发生交换 阴离子交换剂活性离子带负电的与带负电的离子基团发生交换,高分子聚合物骨架电荷基团活性离子,38,39,二、离子交换剂的类型,活性基团：SO3H典型交换反应：R SO3H+NaCl R SO3Na+HCl特点：使用时不受pH限制,注：磷酸基PO(OH)2和次磷酸基PHO(OH)作为活性基团的树脂具有中等强度的酸性.,凝胶型离子
17、交换树脂溶胀空隙大孔型离子交换树脂-永久型空隙,离子交换树脂，多糖基类离子交换剂,（一）树脂型,1凝胶型,（1）强酸性阳离子交换树脂,40,（2）弱酸性阳离子交换树脂,特点：羧基树脂在pH7溶液中才能发生交换反应 羟基树脂在pH9溶液中才能发生交换反应,活性基团：羧基COOH，酚羟基OH,典型反应：RCOOH+NaOH RCOONa+H2O,41,（3）强碱性阴离子交换树脂,典型反应：RN（CH3)3OH+NaCl RN（CH3)3Cl+NaOH特 点：使用不受pH限制。,活性基团：,42,（4）弱碱性阴离子交换树脂,活性基团：伯胺基 NH2 仲氨基=NH 叔氨基 N等,特点：酸性溶液中使用,
18、典型反应：RNH3OH+HCl RNH3Cl+H2O,43,2.大网格离子交换树脂,与凝胶型树脂比较有以下优点：交联度高，具有较好的化学和物理稳定性 孔径大，交换速度快，适合交换有机大分子 完全失水也能维持其多孔结构永久空隙度，适合非水溶液交换,在大网格吸附剂上引入离子交换基团,44,3.树脂的命名,（1)标准命名：如0017,(2)俗名：如732#,45,46,(二)多糖基离子交换剂,以纤维素、Sephadex、Sepharose为骨架或改性后为骨架，连接上离子交换基团后形成。,有强酸、强碱、弱酸、弱碱四类：,特点：,孔径大，特别适合有机大分子分离骨架亲水，电荷密度适中，蛋白质不易变性，适合
19、蛋白质分离具有离子交换和分子筛双重功能，分辨率高,47,三、离子交换剂的理化性能,颗粒大小：决定流动阻力和交换速度，20-60目交联度：决定树脂强度和孔径大小含水量：在105-110烘至恒重测定含水量膨胀度：充分吸水前后的体积比密度：干真密度、湿真密度、视密度,湿真密度=树脂湿重/树脂湿颗粒体积(阳树脂湿真密度比阴树脂大)视密度=树脂湿重/树脂床体积 视密度用来衡量装柱所需树脂量,48,8、影响工作交换量因素：离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小及离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。,6、化学稳定性：阳离子交换树脂用碱处理时，不要与2mol/L以
20、上碱液长期接触，阴离子树脂则不超过1mol/L碱液长期接触。强碱型树脂稳定性较差，OH-型树脂在水中不稳定，所以常以Cl-型保存。,7、交换容量：单位质量干树脂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。理论交换容量：又称全交换量、理论交换量 工作交换容量：将树脂装在柱中，当流出液中目的离子出现时（称为漏出点），树脂所吸附的离子量,49,四、离子交换剂的选择性,离子的水化半径：水化半径越小越易被吸附离子化合价：在低浓度水溶液中，离子化合价越大越易被吸附溶液的pH：影响水解电离交联度、膨胀度、分子筛浓度,50,五、离子交换层析的操作,选择离子交换剂的基质,1.离子交换剂的选择,首先确定是阳离子还是阴离子交换剂
21、（强酸或强碱型，还是弱酸或弱碱型？）,51,流程：充分溶胀去除杂质和细小颗粒用酸碱分别浸泡水洗至中性排除气泡说明：市售阳离子交换树脂一般为Na型，阴离子交换树脂一般为Cl型。处理时一般阳离子交换树脂最后用NaOH碱处理，阴离子交换树脂最后用HCl酸处理。使用的酸碱浓度一般小于2 M，浸泡时间一般30 min。,2.离子交换剂的处理,52,离子交换用的层析柱一般粗而短；直径和柱长比一般为1:10到1:50之间；层析柱安装要垂直；装柱时要均匀平整，不能有气泡。,3.层析柱,53,平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定；要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽
22、量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。,4.平衡缓冲液,平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。,54,离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上柱量应小于工作交换量，一般为1-10%。上柱：正上柱，反上柱（倒上柱）,5.上样,55,在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来。改变pH的洗脱对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。,6
23、.洗脱缓冲液,保证在洗脱液梯度范围内，所有组分都是稳定的。要使结合在离子交换剂上的所有组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱。梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。,洗脱液的选择：,56,洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好。但过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。,7.洗脱速度,57,离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品
24、要进行浓缩、脱盐处理。,8.样品的浓缩、脱盐,9离子交换剂的再生和转型,再生：是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。离子交换剂的转型：是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。,58,六、离子交换树脂的应用,水的净化小分子物质的分离：树脂型离子交换剂大分子物质分离：亲水性离子交换剂,59,第五节 亲和层析技术,亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。,优点：高度选择性、操作条件温和、应用范围窄缺点：层析剂价格贵,60,一、亲和层析的分离原理,被固定在载体（基质）上的分子称为配体（配基），配体
25、和载体共价结合，构成亲和层析的固定相亲和吸附剂。,利用目标分子与其配体之间的特异性生物亲和力（特异、可逆），对其进行分离。,61,选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括:选择合适的配体、载体和连接臂；将配体偶联到载体上；封闭偶联载体上的裸露活化集团；储存亲和吸附剂。,一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的载体，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。Pharmacia公司的Sepharose4B、6B是目前应用较多的载体基质。,二、亲和吸附剂,1、载体,62,基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化
26、学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。,2、基质的活化,63,在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。,3、间隔臂分子,目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售，可以省去基质活化、配体偶联等复杂的步骤。,加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。,64,三、亲和层析的基本操作,装柱平衡制备粗样加样（吸附）洗去杂蛋白洗脱（特异性洗脱、非特异性洗脱）再生与保存,65,END!,
