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1、薄层色谱法thin-layer chromatographyTLC,薄层色谱法,把吸附剂均匀地铺在一块光洁的玻璃板或其他薄板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离分析的方法。特点：1.设备简单，操作方便。2.分离的组份可保存在薄板上。3.对试样净化要求低，试样间相互 无交叉污染。,第一节薄层色谱法的原理,薄层色谱法按固定相的性质和分离机理分为：吸附薄层色谱法，分配薄层色谱法，离子交换薄层色谱法，凝胶薄层色谱法。吸附薄层色谱法：以吸附 剂为固定相，溶剂为流动相（又为展开剂）的液相色谱法。分离机理：在薄层的一端点上试样溶液，然后把薄层的下端浸入合适的溶剂中，借助毛细管作用使溶剂上升。此时试样组分不断地
2、被吸附，又被溶剂溶解解吸，如此随之向前移动，这一过程为展开。,由于吸附剂对不同组份有不同的吸附能力，展开剂也有不同的解吸能力，因此在流动相向前流动的过程中，不同组分移动的距离不同，从而得到分离。,比移值示意图,溶剂前沿,起始线,a,b,c,A,B,比移值：表示各组分在薄 层板上的位置，是定性的参数。Rf=原点至组分斑点中心的距离/原点到流动相前沿的距离比移值与容量因子和分配系数的关系：为反比关系Rf 值在01之间，合适的Rf 值为0.20.8，最佳Rf 值为0.40.5,相对比移值：将试样与参照物同时展开，可消除一些系统误差，用于定性结果准确。Rst=原点到组份斑点中心的距离/原点到参照物斑点
3、中心的距离若A为试样，B为参照物，Rst=a/b 注意：Rst 1或Rst 1 分离度：R=2 d/w1+w2 d两组分斑点中心距离 w1、w2分别为两斑点宽度R 1为两组分斑点分离的标志,固定相,TLC对固定相的要求；1、表面积要大，2、在展开剂中不溶，3、具有可逆的吸附性，4、便于观察分离结果。固定相的选择：根据被分离化合物的性质来选择合适的固定相对于强极性试样，应用活性低的吸附剂；对于弱极性试样，应用活性高的吸附剂。,分离亲脂性化合物常选择氧化铝、硅胶等。分离亲水性化合物常选择纤维素、离子交换树脂、硅藻土及聚酰胺等。注意：吸附剂的酸碱性应与试样保持一致，以防止吸附剂与试样组份发生酸碱反应
4、而产生不可逆吸附。,流动相（展示剂）,选择合适的流动相是TLC离的关键。要求：1、能使待测组份很好地溶解，不与组份发生化学反应。2、使展开的斑点园而集中，无拖尾现象。3、使待测组份的Rf 值最好在之间，各组份Rf 应大于0.05，以便完全分离。,流动相的选择原则：相似性原则。通过实验找出最佳分离的展开剂。实验时，首先用单一的低极性溶剂展开，后再更换极性大的溶剂。用单一溶剂不能分离时，可用两种或两种以上的混合展开剂。常用单一溶剂的极性顺序：已烷（石油醚）二硫化碳 苯 四氯化碳 二氯甲烷 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 丙醇 甲醇 水,常用的混合展开剂：水乙醇，水甲醇，水丁酮甲醇，水乙醇丁酮乙酰丙酮等。注意
5、：混合溶剂临用时新配，以免时间贮存，因相互作用而变质。为了找到最佳溶剂系统，可采用三角形优化法。,三角形优化法,固定相,活性级别,待测物,极性,极性,展开剂,V,I,注：活性级别越小，吸附力越大,强,强,薄层色谱法的基本技术,步骤：制板、点样、展开、显色定位、定性、定量。制板：软板：用硅胶H（不加粘合剂）硬板：用硅胶G（加粘合剂煅石膏）用硅胶CMC（加粘合剂羧甲基纤维素）用硅胶F254（加荧光剂）要求：吸附剂涂铺均匀，表面光滑，厚度一致。注意：涂铺后的薄板应水平放置，室温晾干，干燥活化。（活化温度、时间可根据活性要求变化。硅胶G板在110烘干1小时。）,点样,试样溶于适当溶剂中，尽量避免用水。
6、常用乙醇、甲醇配备，试样溶液浓度为0.01%-0.1%。点样用管口平整的毛细管或平头微量注射器。试样溶液点在距薄层底边约2cm处，点样直径不超过5mm，点间距为1-1.5cm。,1、点样应在干燥的条件下完成，点样时间不超过10分钟。2、点样时要原点的直径一致，点间距要精确，以确保定量分析的准确性。3、点样时宜分次点样，每次点样后必须干燥后再点第二次。4、若试样中欲测成份含量太低或含有的杂质使展开后的背景太深时应进行萃取分离或点样前的衍生化处理。,注意,展开,点样后的薄层板要置于密闭的玻璃层析槽中用合适的展开剂展开。展开方式：软板只能进行水平展开。硬板可采用近水平、上行、下行、双向、多次展开。,
7、注意,1、点样处不能浸入展开剂中。2、展开距离一般为10-15cm，取出薄层板在前沿作记号。3、展开过程中要恒温恒湿。4、当使用极性相差较大的多组份混合展开剂时，要防止边缘效应。,边缘效应,边缘效应：薄层边缘处由于展开剂中非极性成份较易挥发而使比移值比薄层中间部位增大的现象。产生原因：展开槽内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的蒸发速度在薄板两边与在中间部分不等。展开剂中极性较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发得快，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂比例增大，故比移值相对较大。,显色定位,1、光学检出法2、蒸气显色法3、试剂显色法,定性,用试样与标准对照定性，常用的方法：1、用斑点的比移值或相对比移值。2、用
8、斑点的显色特性。3、斑点原位扫描。4、与其他方法联用。注意：用比移值定性时，最好将样品与标准品在同一块板上，用两种以上不同组份的展开剂展开。,定量,1、目视法2、面积测量法3、斑点洗脱法4、用薄层扫层描仪：是用一束长宽可以调节的一定波长一定强度的光照射到薄层斑点上，进行整个斑点扫描，通过测量斑点光束强度的变化达到定量的目的。根据测量方式可分为吸收测定法和荧光法。根据扫描方式可分为线性扫描和锯齿扫描。,薄 层 扫 描 图,光束,薄层扫描仪吸收测定图示,光源,检测器,薄层板,高效薄层色谱法high performance thin-layer chromatographyHPTLC,高效薄层色谱法
9、,HPTLC是在普通TLC基础上发展起来的一种更为灵敏、高效、快速、精密、准确的薄层技术。HPTLC采用了小颗粒吸附剂制备均匀薄层，分离效率比TLC提高了数倍，分析时间也缩短了。HPTLC所用高效薄层板的商品化和点样、展开、显色、定量等一系列操作向仪器化的发展，大提高了该法的重现性和准确性。HPTLC广泛用于体液及组织中药物及其代谢产物的含量测定。,纸色谱paper chromatographyPC,纸色谱法,纸色谱法是以滤纸为载体的色谱方法。固定相：载体滤纸 固定液滤纸吸取的水份 流动相：有机溶剂分离原理属于正相分配色谱法被测组份在固定相和流动相之间进行分配时，由于各组份分配系数的不同得到分
10、离。分配系数的大小直接与化合物的分子结构有关。化合物极性大或亲水性强，则分配系数大，比移值小；化合物极性小或亲脂性强则分配系数小，比移值大。,操作,纸色谱的操作与薄层色谱法相似，有滤纸的准备、点样、展开、显色、定性、定量。注意：1、滤纸要用色谱纸。要根据分离的对象和分离分析的目的选择滤纸型号。2、展开剂应预先用水饱和，防止固定液遗失。常用水饱和的丁醇、正戊醇、酚等。要根据欲分离物质在两相中的溶解度和展开剂的极性来选择合适的展开剂。3、展开方式可采用上行法、下行法（适用于难分离、比移值小的物质的分离）、径向展开。,应用,纸色谱法具有简单、分离 效能较高、所用仪器设备价廉、应用效广泛等特点。在分析水溶性成份如糖类、氨基酸、无机离子等物质，其分离效果优于薄层色谱法。,
