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1、发酵工程制药,第一节 概述,又称微生物工程，是利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术。现代发酵工程已形成完整的工业体系，包括抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、有机溶剂、多糖、酶制剂、单细胞蛋白、基因工程药物、核酸类物质及其他生物活性物质等的生产。,发酵工程,利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。,发酵工程制药的定义,发酵工程的4个阶段,第一阶段1676年制成第一台显微镜 微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起
2、的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶,第二阶段对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。,第三阶段20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。,第四阶段20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合技术等高新技术应用阶段。,Fermentation engineering,上游工程UPSTREAM PROCESSES,下游工程DOWNSTREA
3、M PROCESSES,发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程,UPSTREAM PROCESSES-genetics,cell-inoculum development media formulation sterilization-inoculation,上游工程,Fermentation engineering,DOWNSTREAM PROCESSES-product extraction,purification&assay-waste treatmentby product recovery,下游工程,Fermentation engineering,1、
4、微生物菌体的发酵,SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂,细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段。,微生物发酵类型,2、微生物酶发酵,各种酶制剂：糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶：抗癌纳豆激酶、链激酶：治疗血栓青霉素酰化酶：青霉素生产,需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。,3、微生物代谢产物发酵,初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物：与菌体生长不相伴随
5、，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感,4、微生物转化发酵,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。,反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。,如：甾体转化,可的松（Cortisone）,发酵技术的应用,产物：微生物细胞，酶，活性物质，特殊化学品和食品添加剂。,发酵工业简介发酵食品有机酸氨基酸核酸类物质酶制剂医药工业（抗生素）饲料工业（单细胞蛋白）环境工程（废物处理）其它（冶金工业）,Fermentation Industry Ferment
6、ed FoodsOrganic AcidsAmino AcidsNucleotidesEnzymes Pharmaceutical(Antibiotics)Feedstuff(eg.SCP)Environmental Application(Waste Treatment)Others(eg.Metallurgical industry),药用发酵产品分类,生物来源,作用对象,作用机制,化学结构,细菌真菌放线菌,抗菌药抗肿瘤药抗病毒药除草剂酶抑制剂免疫调节剂,抑制细胞壁合成药影响细胞膜功能药干扰蛋白质合成药抑制核酸合成药抑制生物能量反应药,抗生素维生素氨基酸核苷酸甾体激素酶及酶抑制剂,发酵工程
7、制药的特点,微生物菌种选育获得高产发酵的理论产量存在约10%的变量发酵过程常温常压，操作条件温和纯种培养、无菌条件生产过程是以生物体的自动调节方式进行的分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段投资少、见效快,发展趋势,利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素促红细胞生成素等；新型菌体制剂和疫苗。,红细胞生成素(治疗贫血)生长激素(促进生长)胰岛素(治疗糖尿病)干扰素(抗病毒、抗肿瘤),第二节 发酵制药中的微生物,常见的制药用微生物,细菌放线菌真菌,细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli),生产天冬氨酸、苏氨
8、酸、缬氨酸等氨基酸类药物基因工程的载体,细菌之短杆菌属(Brevibacterium),维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。,细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium),生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542,细菌之芽孢杆菌属(Bacillus),生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12用于甾体转化等,细菌之假单胞菌属(Pseudomonas),生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类进行类固醇（甾体）转化有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白,细菌之乳酸杆菌属(Lact
9、obacillus),生产抗癌类药物,放线菌,抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。,放线菌之链霉菌属(Streptomyces),灰色链霉菌(Streptomyces griseus)产链霉素金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)产红霉素龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)产土霉素,放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia),生产利福霉素、蚊霉素等。,放线菌之小单胞菌属(Micromonospora),多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆
10、大霉素。,真菌之根霉属(Rhizopus),生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。,真菌之曲霉属(Aspergillus),生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。,真菌之青霉属(Penicillum),产黄青霉(Penicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸。,真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium),产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)都生产头孢菌素C,真菌之酵母菌属(Saccharomyces),啤酒酵母(Sacch
11、aromyces cerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。红酵母(Rhodotorula)：-胡萝卜素棉病针孢酵母(Nematspora gossypii)：核黄素,真菌之其它,牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。,发酵菌种的选育要求,生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少。
12、操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离。稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化。安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素。,诱变育种的理论依据是DNA分子结构的改变。分为：,菌种选育,自然选育诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程,从自然界中获得新菌种,土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株,诱变育种,物理或化学方法诱发突变。物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等,自然选育：不经人工处理利用微生物的自然突变进行育种的过程。诱变育种：利用物理、化学等因素，诱发基因突变，并
13、从中筛选出具有某一优良性状的突变体。杂交育种：借助基因重组，使不同菌株的遗传物质得以交换。原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换。基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广。,基因突变及其机制,诱变育种操作步骤,质 粒 育 种,转基因工程菌的构建,菌种保藏(Culture conservation),目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。,菌种保藏三要素,典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。,菌种保藏的常用方法
14、,斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法,第三节 发酵方式,（一）分批培养（二）连续培养（三）其它培养方法,（一）分批培养,1、分批培养的定义,2、分批培养的生长过程,3、分批培养过程中影响细胞生长的因素,1、分批培养的定义,分批培养是一种间歇式的培养方法，在每一批次的培养过程中，不再加入其它营养物料。待生物反应进行到一定程度之后，将全部培养液倒出、进行后道工序处理。,为了提高生物反应器在分批培养中的效率通常采用多级分批培养的办法。即在小型生物反应器中接入少量种子经过分批培养，来获得较大数量的细胞作为种子再转入到大型生物反应器
15、中,分批培养的设备要求较少操作也较简单工业微生物生产中经常采用,2、分批培养的生长过程,培养中的细胞经过4个生长阶段：（1）延迟期（2）指数生长期（3）静止期（4）衰亡期,1、延迟期（1）种龄越长，延迟期越长，（2）接种量越少、延迟期越长。,4、衰亡期营养物质消耗贻尽培养液中有害物质积累太多导致培养液中的细胞开始死亡，称为衰亡期。,3、静止期随着营养物质被逐渐消耗、细胞的生长速率开始下降，最终细胞浓度不再增加，称为静止期。,2、指数生长期细胞的倍增时间指细胞浓度增长一倍所需要的时间。微生物的倍增时间一般为0.5-1小时。,3、分批培养中影响细胞生长的因素,共有以下5种影响因素：（1）营养物质浓
16、度（2）温度（3）pH值（4）溶解氧浓度（5）产物,（1）营养物质浓度,营养物质的限制性浓度-当某一种营养物质的浓度下降到一定程度之后，就会影响细菌的生长，此时的浓度就称为营养物质的限制性浓度。营养物质的最大浓度-当某一种营养物质的浓度超过一定程度之后，也会对细菌的生长产生抑制作用。,（2）温度,当培养温度偏低时，细胞的生长速率较低，随着温度的升高，细菌的生长速率也随之加快，当温度超出一定范围时，由于蛋白质等细胞结构的变性，导致细菌生长速率的急速下降。,微生物细胞的最适生长温度并不等于其代谢产物的最佳生产温度。因此在具体的生产过程中，培养的前期常常将温度调控在有利于细胞生长的区域，而在后期则常
17、常将温度转到最佳的生产温度，以获得较多的产物,根据培养温度的要求的不同，可以将微生物分成：低温菌，中温菌，高温菌。采用高温菌生产有许多优点：（1）高温菌所生产出的酶，其热稳定性较好。（2）高温菌的培养温度较高，细胞的生长速率较大。（3）不容易发生杂菌污染。（4）在大规模生产时可以节约冷却水、同时能够减少动力消耗。,发酵温度调控技术,（3）pH值,细菌适宜于在中性、弱碱性的条件下生长。酵母菌、霉菌则喜酸性环境。乳酸菌、醋酸菌对于低PH值环境有着很好的耐受性。,（4）溶解氧浓度,不同的培养过程对于溶解氧有着不同的要求应该根据具体情况来加以控制。,空气过滤片,（5）代谢产物的抑制作用,细胞的代谢产物
18、会影响到细胞的生长，这种现象称作产物抑制作用。而代谢产物多数就是生物制物的原材料。因此，在实际生产过程中要设法定期收集细胞的代谢产物,（二）连续培养,1、连续培养方法的优缺点2、连续培养法的分类,细菌连续培养的设备简化示图,1、连续培养方法的优点（1）细胞生长速率较高。（2）连续培养可发使得培养液达到一个稳定状态,2、连续培养方法的缺点（1）连续培养延续的时间长，发生杂菌污染的概率也就增加（2）长时期进行连续培养，细胞发生变异、质粒丢失、基因突变、（3）细菌株生产性能退化的现象也就比较突出,3、连续培养法的分类,可以分为以下3类：（1）单级连续培养（2）细胞回流式的单级连续培养（3）多级连续培
19、养,（1）单级连续培养,新鲜培养基的加入速率=培养之后的物料抽出速率。这种培养方法称为单级连续培养法。在单级连续培养方法之中，发酵液体积保持恒定，生物反应器中各组分分布均匀。单级连续培养是一种最简单的连续培养方法。,（2）细胞回流式的单级连续培养,将单级连续培养流出液中的细胞加以浓缩，然后再送回到生物反应器中，这种方法称为细胞回流式的单级连续培养。细胞回流式的单级连续培养相当于不断地对生物反应器进行接种，有利于提高连续培养的效率。,（3）多级连续培养,将几个生物反应器串联起来，第一个反应器的流出液作为第二个反应器的流入液，第二个反应器的流出液又作为第三个反应器的流入液，这种培养方式就称为多级连
20、续培养法。,（三）其它培养方法,1、补料分批培养2、透析培养3、萃取培养4、闪蒸培养5、离子交换培养,1、补料分批培养,补料分批培养法是介于分批培养和连续培养之间的一种操作方法。是指在进行分批培养中间，向生物反应器中加入营养物质进行补料，但同时不取出培养液的方法。（1）方法改良（2）补料分批培养的优点（3）补料分批培养的缺点,由于补料，使得培养液的体积逐渐扩大，到一定时间之后，再将培养液从反应器中一次性放出,（1）方法改良,连续补料分批培养法在进行补料分批培养时，如果所取出的培养液数量少于补进的物料数量，反复进行多次的放料和补料操作，这种方法称为连续补料分批培养。,（2）补料分批培养的优点,（
21、1）通过流加高浓度的营养物质，培养罐内的细胞浓度可以达到非常高的程度这对于细胞产物的生产十分有利,（3）通过补料，能够解除某些营养物的低浓度限制效应提高产物的合成效率。,（2）通过补料和放料的连续进行，能够解除某些基质、产物对细胞的抑制作用,（3）补料分批培养的缺点,（1）要考虑到生物反应器的供氧能力,（2）要考虑培养过程中大量代谢产物积累后的细胞毒性,第四节 发酵设备及消毒灭菌,发酵的一般流程,发酵设备发酵罐,发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）,发酵罐的类型搅拌釜反应器鼓泡式反
22、应器气升式反应器,发酵设备发酵罐,发酵辅助设备,无菌空气系统灭菌系统、管道、阀门,培养基及其灭菌,培养基（medium）培养基的成分碳源氮源无机盐前体物促进剂抑制剂,培养基灭菌空罐灭菌实罐灭菌连续灭菌,第五节 发酵工程制药的过程与控制,发 酵 过 程,即微生物反应过程，指由微生物在生长繁殖过程中所引起的生化反应的过程。根据对氧的需要分：厌氧和有氧发酵。根据培养基物理性状分：液体和固体发酵。根据微生物生长特性分：分批发酵和连续发酵。,发酵的一般过程,发酵过程,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,菌种,选育 目的是改善菌种的特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。基本方
23、法 自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的选育、诱变育种、代谢控制育种及原生质体技术和体外重组DNA技术（基因工程）等。,菌种,种子罐级数,指种子需逐级扩大培养的次数。一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量少，故种子罐级数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种子罐后于320C培养7-10h，菌浓达到108-109个/ml，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。,种子罐级数,对生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐270C培养40h后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于270C培养1024h移至发酵罐
24、作为种子，称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,发酵过程,种子扩大培养流程图,生理代谢菌种筛选,种子培养,发酵培养,发酵,微生物发酵方式,分批发酵补料分批发酵半连续发酵连续发酵,发酵过程中的中间分析项目,产物产量pH糖氨基氮菌丝形态,发酵过程的影响因素及控制,菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点的判断,菌体浓度在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。特别是初级代谢产物。菌体浓度过低，产物产率下降。菌体浓度过高，产生其他影响。措施：调节培养基中的营养物质的浓度。,营养物质碳源氮源磷酸盐：生长亚适量浓度补料：半饥饿状态,温度考虑菌种及生长
25、阶段综合考虑其他培养条件考虑菌种生长情况发酵热,pH补加酸或碱和补料的方式,溶氧和CO2溶氧异常下降溶氧异常上升 措施？,泡沫负面影响措施,染菌发酵前期染菌发酵后期染菌,发酵终点的判断提高产物的产量和经济效益降低生产成本,第五节 生产实例,抗生素类氨基酸类维生素类其它有机物与医药中间体,一、抗生素的分类,按进行生产的微生物母体分：（1）细菌生产的抗生素短杆菌肽，短杆菌肽S、杆菌肽、多粘菌素B。（2）霉菌生产的抗生素青霉素、灰黄霉素、甾酸菌素。（3）放线菌生产的抗生素链霉素、氯霉素、金霉素、四环素、红霉素、螺旋霉素、利福霉素、卡那霉素、交沙霉素、麦迪加霉素。,按化学结构分：（1）-内酰胺类抗生素
26、青霉素类、头孢菌素类。（2）氨基糖苷类链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素。（3）大环内酯类红霉素、竹桃霉素、麦迪加霉素、制霉菌素。（4）四环素类土霉素、金霉素、四环素。（5）多肽类杆菌肽、多粘菌素B,二、发酵法可以生产的种类,（1）青霉素（2）头孢菌素（3）链霉素（4）卡那霉素（5）庆大霉素（6）红霉素（7）罗红霉素（8）麦迪霉素（9）乙酰螺旋霉素（10）四环素（11）土霉素（氧四环素）（12）金霉素（氯四环素）（13）林可霉素（14）多粘菌素（15）杆菌肽,三、生产和制造实例,（1）青霉素（penicillin）,青霉素发现者弗莱明,菌种：黄青霉菌原始材料：-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。发
27、酵方法：加前体物质的深层发酵法。,沙土管菌种转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养5-6天，获得芽孢芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养,进入移种瓶培养进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，28培养48-96小时进入发酵罐，开始生产,鼓式过滤第一次萃取器纯化柱第二次萃取器第三次萃取器,真空结晶釜瓷过滤器结晶洗涤釜真空干燥器,程序,（1）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。（2）温度控制在2430、pH值控制在6.87.2。（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、pH值、氨、氮、溶解氧量。（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须
28、是无菌的。（5）发酵罐必须保持正压（2030kPa），以防罐外不洁净的空气流入。（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位/ml，相当于50g/L。,生产细则,（2）链霉素,（1）生产准备（2）工艺流程（3）生产细则,（1）生产准备,生产用菌种链霉菌、小单孢菌原始材料氨基酸、酵母培养基黄豆饼粉、糊精、淀粉、葡萄糖、碳酸钙、微量元素。,(2)工艺流程,菌种斜面培养斜面种子摇瓶培养摇瓶种子种子罐培养2-3级种子培养液发酵罐培养发酵液过滤滤液阳离子交换树脂进行吸附交换饱和树脂洗脱洗脱液脱色、脱盐、浓缩成品浓缩液无菌过滤、干燥成品,（3）生产细则,（1）发酵温度2528。（2）采用间隙补料、或者流加补料的工艺。（3）发酵5-7天。（4）板框过滤离心分离离子交换精制喷雾干燥。,（3）氨基酸类,L-赖氨酸L-苏氨酸L-苯丙氨酸L-异亮氨酸L-亮氨酸L-缬氨酸L-组氨酸,（4）维生素类,VCVAVD2VD3VB1VB2VB12VE,（5）其它有机物与医药中间体,柠檬酸乳酸葡萄糖酸醋酸乙醇丙酮甘油,结 束,思考题,p309：2、3、4补充：1.微生物发酵类型有哪些？2.什么是微生物的生长曲线？阐述其特点。术语解释：原生质体融合 碳源 氮源 发酵热 自然选育 诱变选育 分批发酵 连续发酵,
