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1、医学微生物学实验室规则,一.进入实验室必须穿白大衣,不必需的物品不要 携带入室。二.保持实验室的安静和秩序,实验要严肃认真。三.如有传染性材料的污染,及时报告老师。四.实验过程中有仪器和器材的损坏要报告老师 并登记。五.实验后的材料要放到指定的位置。六.离开实验室前,要用肥皂洗手,接触过传染性强 的实验材料要用0.1%的新洁尔灭泡手1-2分钟七.值日生要作好值日工作,关好水,电,门窗,作好 实验记录本的登记方可离开实验室。,目的要求:1、了解微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备 2、了解空气、皮肤细菌检查方法 3、掌握药品的微生物学检验程序和方法,实验一 药品的微生物限度检查（一）实验室常用消毒
2、灭菌设备 空气和皮肤细菌检查方法,一.药品的微生物限度检查（一）,1.口服药物的微生物检查:大肠杆菌的检查：细菌总数的检查2.外用药物的微生物检查:绿脓杆菌的检查：金黄色葡萄球菌的检查：,口服药外用药,药品的微生物限度检查实验方法（一）,1.药品的预处理,2克药品加20毫升生理盐水，研磨制成悬液,2.细菌培养,外服药,口用药,药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中,药品混悬液10毫升加入胆盐乳糖增菌液中,药品混悬液10毫升加入亚碲酸钠增菌液中,37,24小时,37,24小时,将剩余口服药以10-1 10-2 10-3 10-4 进行稀释(以生理盐水稀释),3.细菌总数测定,加溶化的琼脂培养基中
3、，混匀，冷却后,置37恒温培养箱培养24小时。,取三个中试管,各管加9ml生理盐水,从剩余10ml悬液中取1ml加入第一个稀释管中,1ml,10-1,10-4,10-2,10-3,9ml生理盐水,从上述三个稀释管中各取1ml,1ml,10-1,10-4,10-2,10-3,二.空气、皮肤细菌检查方法(验证)三.微生物学实验室常用消毒灭菌仪器设备：高压蒸汽灭菌锅 消毒煮沸器 G6玻璃滤菌器装置 洁净工作台 移动式 紫外光灯 鼓风式干烤箱 紫外线杀菌标本。,厌氧工作站,催化剂（钯粒）,厌氧培养罐,电热恒温培养箱,二氧化碳培养箱,一、目的要求:1、了解细菌培养接种技术 2、掌握细菌基本形态 3、掌握
4、药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药物的微生物限度检查（二）2.空气、皮肤细菌检查结果测定。3.讲授基础培养基的制备方法（营养琼脂、营养肉汤）。4.培养基的种类和用途 普通培养基、营养培养基、厌氧培养基、选择培养基5.细菌在三种不同物理性状培养基上的接种方法(基本技能)液体培养基 平板培养基斜面培养基 双糖含铁半固体斜面培养基6.显微镜下观察 细菌的基本形态:球菌、枯草杆菌、霍乱弧菌。特殊结构：肺炎荚膜、变形鞭毛、破伤风芽胞。,实验二 药品的微生物限度检查（二）细菌的形态学检查及培养接种技术,取出前次实验培养物观察：1.口服药物1)细菌鉴定：在胆盐乳糖增菌液中有无细菌生长：增菌液变混
5、浊有-接种在伊红美兰琼脂平板培养基 上面。方法：分区划线接种。2)细菌总数测定：选择30-300个菌落平板，细菌总数菌落数稀释倍数,药物的微生物限度检查方法（二）,2.外用药1)判定胆盐乳糖增菌液培养物及亚碲酸钠增菌液培养物有无细菌生长：增菌液变混浊有2)细菌鉴定：（1）将胆盐乳糖增菌液培养物无菌接种在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上面。方法：斜面化线接种；（2）将亚碲酸钠增菌液培养物，无菌接种在卵黄高盐琼脂平板培养基上面。方法：分区划线接种。37恒温孵育箱24小时培养后，观察结果。,分区划线法,菌落,斜面移种技术,菌苔,液体移种技术,细菌基本形态,球菌,杆菌,螺形菌,葡萄球菌,链球菌,大肠
6、埃希菌,枯草杆菌,霍乱弧菌,细菌特殊结构,鞭毛,荚膜,芽孢,破伤风梭菌,spore,一、目的要求:1、了解细菌的生长现象及代谢产物的观察 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容1.药物的微生物限度检查（三）2.细菌的生长现象及代谢产物的观察 1）液体培养基-沉淀、浑浊、表面生长现象。2）三葡、三链、大肠与副伤乙培养基的菌落特征、溶血环观察。3）双糖含铁培养基-动力、气体、硫化氢、分解乳糖观察。4）结核杆菌菌落的观察。3.中草药、抗生素抑菌试验 1）中草药-大蒜汁、黄连、黄芩、黄柏。2）抗生素-青霉素、庆大、氨苄、新诺明、生理盐水。,实验三 药品的微生物限度检查（三）微生物的形态学检查
7、及药物的敏感性试验,1）从伊红美兰琼脂平板培养基上-挑取黑色带有金属光泽的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。2）观察外用药物在16烷三甲基溴化胺琼脂斜面培养基上生长状况。记录被检菌色素的溶解性质、液化明胶的状况及菌苔粘稠度等。革兰氏染色镜下观察其菌落形态。根据上述被检菌落的生物性质和状况及细菌形态，确定该被检菌的名称。3）从卵黄高盐琼脂平板培养基上生长，挑取黄色的湿润菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上面，进行细菌的纯培养。,药物的微生物限度检查（三）,2.细菌的生长现象及代谢产物的观察,混浊生长,菌膜生长,革兰染色步骤,1.制片：取标本（球杆混合物、牙垢）涂片、干燥、固定
8、2.初染：结晶紫1min水洗3.媒染：碘液1min水洗4.脱色：95%酒精30s水洗5.复染：沙黄1min水洗、滤纸吸干6.油镜观察：,1、制片涂片、干燥、固定,2.结晶紫初染 1min水洗,3.碘液媒染 1min水洗,4.95%酒精脱色 30s水洗,5.沙黄复染 1min水洗、滤纸吸干,6.油镜观察结果,革兰阳性菌：紫色革兰阴性菌：红色,3.中草药、抗生素抑菌试验,纸片法,实验四 药物的微生物限度检查（四）病毒和细菌及其他病原微生物,一、目的要求 1、了解抗酸染色方法及各种病毒和细菌的菌落形态 2、掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容 1、药物的药物的微生物限度检查（四）1）将口服药
9、物中的细菌分别接种：蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；枸橼酸盐（西蒙氏）培养基。同时接种产气杆菌于上述培养管做对照，以备进行IMViC试验。2）取接种在普通琼脂斜面培养基上面的外用药物中细菌进行血浆凝固酶检测,依 据 其反应结果,确定该菌的性质及名称。2、抗酸染色3、真菌培养物的观察-黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌丝，酵母菌菌落的观察。4、记录中草药、抗生素抑菌试验结果 5、流感病毒的血球凝集试验6、观察鸡胚的结构7、抗“O”试验,接种细菌的对应生化反应管,制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸复红初染（加热、盖滤纸片）5min-水洗；3盐酸酒精脱色（15S,水洗）；美兰复染（1min
10、，水洗）-滤纸吸干镜检。,抗酸染色步骤,结核杆菌,抗生素体外抑菌试验（二）记录纸片法结果测量抑菌环直径,病毒的分离培养鸡胚接种,动物接种 鸡胚培养组织细胞培养,病毒的培养方法：,病毒的分离培养鸡胚接种,病毒的分离培养鸡胚培养,菌 丝,大分生孢子,小分生孢子,白念珠菌,新型隐球菌,青霉,烟曲霉,黄曲霉,曲霉,实验五 药物的微生物限度检查（五）,一、目的要求掌握药品的微生物学检验程序和方法二、实验内容以生化反应（IMViC）检测口服药中细菌的性质。,-,吲哚试验左：产气肠杆菌（），右：大肠埃希菌（+）,甲基红试验：左：产气肠杆菌（）；右：大肠埃希菌（+）,VP试验 左：大肠埃希菌（）；右：产气肠杆菌（+）,
