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1、基因工程郭玉柱,1.1基因工程的基本操作工具,1、概念：定向改造生物性状，解读2、原理：基因重组3、操作水平：DNA分子水平4、操作工具：（1）限制性核酸内切酶-分子手术刀 1）来源：微生物（原核+真菌）2）作用特点：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。,3）结果：形成平末端或粘性末端（2）DNA连接酶分子缝合针1）种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA 连接酶2）作用特点：使两个DNA分子片段之间形成磷酸二酯键，从而使之连接在一起。E.coliDNA连接酶只连接粘性末端，T4DNA 连接酶两种末端都能连，但连接平末端效率低。
2、,比较限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶的异同点？相同点：都作用于磷酸二酯键不同点：1）限制酶切割DNA的磷酸二酯键2）DNA连接酶连接双链DNA片段形成磷酸二酯键。3）DNA聚合酶使单个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。4）RNA聚合酶使单个核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键。,（3）运载体-分子运输车1）种类：质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒2）天然质粒不能作为运载体，需要加工修饰后才可以。3）质粒作为运载体满足的条件：1、有一个至多个限制酶切位点，便于目的基因插入。2、能在宿主细胞中自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA同步复制。,3、具有标记基因（如抗生素抗性基因、荧光标记基
3、因），便于将含有目的基因的细胞筛选出来。4、大小适宜，对宿主细胞无伤害。,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形
4、成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库(cDNA library),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,基因文库的分类,2.基因文库的构建方法,：直接分离法,供体细胞中的DNA,许多DNA片段,运载体,限制酶,受体细胞,产生特定性状,导入,外源DNA扩增,目的基
5、因,分离,(鸟枪法),一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,多用于原核生物,反转录法,目的基因的信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,逆转录,2.基因文库的构建方法,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,人工合成法（真核生物）,推测,推测,单链DNA,合成,基因组文库的构建,（2）.基因文库的构建方法,通过对受体菌的培养而储存基因,cDNA文库的构建-反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录
6、酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,2、利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的
7、基因的核苷酸序列（前提条件）,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,3、人工合成法：,基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终
8、获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种蛋白质.,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传
9、信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终止子,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,2、真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核
10、细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、目的：所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,2、基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达
11、必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,三将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法(双子叶）,基因枪法（单子叶）,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点,（2）基因
12、枪法（3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵（或胚胎干细胞)新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子CacL2可以改变微生物细胞壁的通透性,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交
13、带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,（二）、鉴定（个体生物学+分子生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原-抗体杂交,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法等目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,蛋白质工程1、概念2、原理3、是基因工程延伸、与基因工程对比4、途径：见教材。,
