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1、3.2 杂交技术,3.2.1 探针和探针标记,一、概念1、探针（(probe）：带有能检测的标记物的DNA或RNA。2、探针标记：使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。3、杂交：互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程。注意：探针必须经过标记，以便示踪和检测。二、标记方法1、切口平移标记2、随机引物标记,切口平移法(nick translation)控制DNA酶浓度，使DNA的一条链在有限的位置上大开切口，形成3-OH和5-P末端。E.coli DNA聚合酶将核苷酸
2、连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，即将一个个带有标记物的-32 P dNTP加在3-OH末端。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切后平移：DNA的切口从左到右沿着DNA平移的过程。,2.随机引物合成法 随机引物：能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段。随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,能在随机引物的引导下以带有标记物的d
3、NTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。通常产物平均长度为400-600个核苷酸。,利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。,3.2.2 杂交,blot一词，有不同翻译，有人叫“印迹法”，也有人翻译为“斑渍法”，更为普通的是直接称为Southern blot),一、种类 杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到
4、一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。,固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。,二、杂交方法,（一）、斑点印迹(Dot-blot)杂交 将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80真空烘烤2h。应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操
5、作简便、快速，在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量。,（二）、Southern印迹(Southern blot),1、定义：指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。2、原理：将限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析
6、及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。3、作用：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。,4、Southern印迹的操作方法,（1）、毛细管转移(或虹吸印迹)。传统方法。进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。安放装置时，在转移槽中央的平台上由下到上依次叠放变性凝胶、滤膜、一叠干的吸水纸巾；凝胶与转移缓冲液通过滤纸桥连接；滤膜上的纸巾吸水产生并维持毛细管作用，液体由于毛细管作用抽吸通过凝胶，并将DNA片段携带聚集在滤膜上。DNA片段的大小和琼脂的浓度决定了转移的速度。小片段DNA(1kb)在1小时内可从 0.7琼脂
7、糖凝胶上几乎定量转移，而大片段DNA的转移较慢且效率较低，如大于15kb的 DNA片段需要18小时而转移尚不完全。,（2）、电转移。利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，可达到简单、迅速、高效的目的。一般2-3小时内可转移完毕。（3）、真空印迹法这是近年来发展起来的一种简单、快速、高效的DNA和RNA印迹法。其基本原理是利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层，凝胶中的核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面的固相支持物上。30分钟至1小时可完成。注意：Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理，对NC膜可用80真空烘烤2小时，对尼龙膜还可用短波紫外线(波长254nm)照射几
8、分钟。,4、Southern印迹的操作过程,酶切DNA,，电泳分离，使DNA原位变性。将DNA片段转移到固体支持物(NC膜)上。预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针（用放射性检测仪探测放射强度）。洗完的膜用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，且保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中，在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。,M P C 1 2 3 4
9、5 6 7 8 9 10,P C 1 2 3 4 5 6 7 8,PCR-Southern检测,部分转BT基因抗性愈伤组织的Southern杂交检测,M 1 2 3 4 5 6 7 8,由于放射形同位素对人体危害很大，故也常常用DIG标记,（三）Northern印迹(Northern blot),1、定义、Northern印迹是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。RNA样品经Northern印迹后进行杂交反应可鉴定其中特异 mRNA分子的量与大小。2、Northern印迹的方法 Southern印迹基本相同。但RNA不能用碱变性，因为碱会导致RNA水解。因此，在North
10、ern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链（消除二级结构）分布在凝胶上，再进行印迹转移。3、RNA变性电泳的方法 用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链。,Northern 杂交和 Southern 杂交主要区别在于：Northern 杂交中待测的物质是 RNA。Southern 杂交中待测的物质是 DNA。,Northern杂交检测,（四）、Western杂交,1、定义、是将蛋白质先经电泳（SDS PAGE 胶）分离，然后转移到固相载体上，最后用特异性抗体进行免疫测定或蛋白质的染色。
11、Western 印迹法又称蛋白质印迹技术，它是70年代末，80年代初发展起来的一种蛋白质检测新技术。其基本过程,2、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,
