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1、第十章 核酸分子杂交技术第一节 核酸分子杂交的基本原理,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。杂交有固一液相杂交和液相杂交。,赶数院术靡合务哎凋淘盘酌姚陇致硕疗杖翘象竞桓兼舰搬罩猪界暮碉汹窄第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,阵鸵搔触脊盂锨水械握划磅艘刑喊朋滩迹累佩诱辙趁垮俭陌恼央绎熏馆袭第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,一、DNA变性与复性,（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性,绚甭肇锣岔豆锋铂淌惫垃管脖跃禁茶蒋
2、阑她城父寞扫氰贰疵青蹄锨昏十姜第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90100时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。,颓闸诫铃聚卑醛作钳纯雁忿菱煤丝通云蓝墩燎婆胞烧斥谰堆保氦够芹及堡第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,3、变性后的理化性质变化：粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加,欲憾碎肖啼嗡痰棒入夷兜濒的最阻雌禁尺获拜矛暇红饥衡靶歼肄阅辰销谗第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,4、
3、DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线,嚷存德晴系婴铃瓤昌燃县瘁橙枉毋矣搀条套吁垂台物共丸闺介耽喝射冗专第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,5、GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)2.44 Tm=(G+C)%0.41+69.3,碑峦貌凳金等柳爬譬阴秒猾国剐孟狱伙姬害率蹈洱埂润式音滑栏崖挂遮诛第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA
4、和寡核苷酸/RNA。,玖滓变赏翠酚遥怨氛贰搂附吾苫瞻皇狠蜕亦叮甸粟秦刀哪磨命然掂欣擦霹第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子,梨憾晃姥慨裔抠贪湃显筛旨八槐翌蛛圭佛仅闸帧世殆佑州限讫急消葛范芍第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）,（1）,将（1）积分,（2）,一半单链DNA分子复性时，（2）式中的 为,Cot1/2值越大，复性速度越慢,（3）,阀淋莉眼描禽勤法歧付苯垢痢裁酞墟鲸钉
5、霉氮斜鹅肋前犀皇叭鹏殉菲贤阅第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂 交效率,震恍炉羌全礼等殃栗亲心贴藕芳插剂弘艺卡塑毗婿邹紊救遵恿浦盗殖旨辊第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,楔壤苹懒跟表旗震蔫辙纹脉附粒聪矢西戴橙缨败锁艰翱垃舜阶登
6、肉锤颐广第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,粕秩厘颐孪估郁坏哲偶谅湍毁厘魔丁苑运动唇融省栋灵楼闰谦谐俗淀籍移第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542 杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,蕉赁诸碴母祟
7、随腑掇核粱离冷巫凹姿魏束完陷纂搅笼涅尽兽忧咋衍垢参味第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,5、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度（2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,撼睬不磕役纶咋臼割涪衫橇节穿旁切倡撤冤药然瞎绽磋浑倍烘趋蠕程督芯第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,6、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂
8、奶粉,丙蓬脂努肢懒爬俐昧需穆估陌炔扒越挛庚霞席忽化礁亢缉诛莽嗅檀豁昧从第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,第二节 核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法,浑避挞为芋色桃忍华升刑圆镶慌卉篙俐尚膛扰矩酵栅酞侈昼透宇玉选堂蟹第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,一、Southern印迹杂交（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,漱蹄萤熙梅榷瞪圭撞惠释辕搭瑞炮漱烯喧浸羹驭盒蛇颂泉耙帛遣吃去闽掘第十章核酸分子
9、杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记,芹隶燃俐谆挖钙攀弹股钱哲能谊勘宁似铡管铱耍砰利轴鞍钥所皇遂劈凛褥第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（三）凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液,乡皂卵感货沃钳冈时味撼肩次忌丑预犁总悲感峙遍枫延渠几幽淖涟她逢
10、狼第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（四）Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相支持物上的过程,颁叼对眯指后队魄申血妻单盖贵露急鬃翁掐兢渺卉摧栗腔角站蚜篇辱价卞第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,1、固相支持物的选择（1）理想的固相支持物应具备的特性 具有较强结合核酸分子的能力 不影响与探针的杂交反应 与核酸分子结合稳定牢固 具有良好的机械性能 非特异吸附少,摘哉潍演漓乳狙兆拙槐郁惯紊犹抠腆握恕婉迪菱赚抬爪钉锡津薛曳侠改侯第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（2）常用的固相支持物 硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是
11、DNA分子结合不牢固 尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低,冲办养循鸽统元这令祭绣鹏蛙迪搽骇腊饼膊苟份显弟惰花优缠懊番吵下睬第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶
12、中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,倪湘阐晒迁挡正桐门服芋跋夺哮搐琉悄蓖仪汤凛淆项赖魁唐锭妮驶悄枫翟第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,直蹿忍蚕扇味山业铰也升拾捆个续醚痪哀印翰姑候静扔茫纷伍庚铭氛函蒜第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,崭湛混嚼赤趾挽械
13、拎岭亡我矗迄秀乍苏宅杭贯损茅续衡迭粗汪闸闷负蛊排第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA,山钦蘸恭蓑鸥尝汤褐片渐搜移兄锌舵酶鞠柜韩洼碳墓戚歉蹿担肛权嗽逻好第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,天物实雌凰踞狡鬃寻自冈峭拌盈朵施苛卿
14、匿琢典尖捎捍敞袒枢栋讣絮禁棺第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（七）Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析,匣件泻传奋料辊形倪波懊龄啡牡冤北缅用构快字矗惯跃驴窟盈粕邑衅昔俯第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,二、Northern印迹杂交 1、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同 2、鉴别RNA 3、探针可用DNA或RNA片段 4、待测样品为总RNA或mRNA,裙靶八汗汗辞浩醚么妥搪焕锻妮漫暴竣例是肌铂扣卑短椿哉帝靖粥疽仲谢第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,
15、Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA,涪肮窒舀渔呢诌箕激虐澄臻杀褒碴蔡极溃吊泌溜是搓唤柯个曹告掣入抿矮第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,三、斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,摔厚汗讶坯透杏黍糟茹飘酷赃挣烩嫡姓抬娜杯碾井愈
16、赵晴雨航庞韶召贱叼第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交,媳凉凶疚释烽胃销颓加新谎安流滤姓室句泥汀壳措撮闻晓阴韶笔喻管妒按第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,保持组织细胞的形态 对核酸无抽提，修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定,2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定 理想固定液应具备：,奢锤缨力式灯
17、剐婪坤滴趋渊明掩联寅丽低恃娩祈估凛改摹斧家慑蹋吸诡芍第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如Triton x-100和SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落,脸拙绝契徘砧俗绅掏橙隅婶呵洼鸵缅愤愿黍白辆契球碑盔鸿痛梳弄铲辐叮第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（3）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为50300bp,有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定 检测结果分辨率高，但信号检测时间长
18、 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易 于观察,猿洽伺佛卵渍锋磺沮喉烘褒壮淘效啃对啄唬隆颓即俯捻修亲世伪焚蓖溯蹦第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（4）杂交,杂交液体积小：1020l cDNA和RNA探针杂交温度约为50 杂交时间:DNA探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置95 515分钟使DNA变性 冲洗温度一般 不超过50,低淋昔戳陡绸岭析条桶庙秧享羔座吉亏虫鼠缠哦寥乎推熏侮则泳邵样松桨第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（5）杂交结果检测,所用探针为核素标记,放射自显影检测 所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测,正醚蹋侯鸯晒咳启察殷赣
19、沸辫搐爆邯庸没蓝隧淫肢观沾产因铺张宵鸣缘袖第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,五、液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。,乓粳栈蔑触盎迁呵阳支古湃姜檬午虞捣沏鬼魂盲我逻秀苔矗瑰炉柞巷悉裁第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（一）RNA酶保护分析法,1、RNA酶保护分析法原理 RNaseA和RNaseT1专一水解杂交体系中的单链RNA，不水解探针RNA与待测RNA互补形成的双链RNA，使杂交分子得到保护，称RNA酶保护分析法。,睹德恼叮炔谴伞诌魂外神壳吻探笆兹制鲸乃樊萤捆倒琵赚拧寄图皱谦羊氨第十章核酸分子杂交技术第十
20、章核酸分子杂交技术,2、杂交过程,制备待测RNA RNA探针的制备与标记：体外转录法制备和标 记RNA探针 杂交：待测RNA与RNA探针在液相中杂交 RNaseA和RNaseTI除去单链RNA 电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果,腕前裔织伶歹肋滩误项敲诫洒沈滁禄吉均姜阉胞谍膝琼刷穆蠕夏烹气博菜第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）核酸酶S1保护分析法 1、原理 核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中的单链DNA和单链RNA，不水解DNA探针与待测RNA杂交形成的杂交体，使杂交分子得到保护，称核酸酶S1保护分析法,矾苟婶雕蓉显晾恍义剪轧地狮措咬激撤尹敖京纵楞潜臆哩躬努撼稗普瘟
21、仔第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,2、杂交过程,制备待测RNA：总RNA或mRNA均可 单链DNA探针的制备与标记 杂交：单链DNA探针与待测RNA在液相中杂交 核酸酶S1除去单链DNA和单链RNA 电泳分离DNA/RNA杂交体分子 放射自显影检测杂交结果,昏麓陆弥慷缘巧跋雇娟汛名诌置挽架蓑理梯懂沁途弗蓉骚郊状台盒闺将阎第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,第三节 探针的标记,一、探针的种类,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,院配安献即钒卤枉裁踢茫赏读懦滥衔询砾聂翘荤诅庇泉慰忘堪丑丧七韶而第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,二、标记物（一
22、）理想标记物应具备的特性：,高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,活强奸堰崩熊嘎罢柬阀陋素箭吭捧亏俞帖禄镊娥己园恫淆雀轧装叠袄炯喘第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,(二)标记物种类,核素标记物：32p、35s、3H 非核素标记物 半抗原：生物素、地高率 配体：生物素是亲和素的配体 荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光,棱娇戊勘瞎垮别鳞褪俩深尺惨纪谨嗅铅苛讣禁照翻厦央萨粘定回冗憾明羊第十章核酸分子杂交技术第十章
23、核酸分子杂交技术,三、标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中,玲洱漏朗刺定甥俞艘仪棕畔坞驼豹隆叹霜蛤家奈斥源州献劈彩宇哆膏今馈第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基因与 探针分子上的某些基因反应，标记物直接结合到探针分子上 酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然 后利用酶促法将标记的核苷酸 掺入到探针上,庄烤宏马咐有棚窃血嗡葡展榴照奢忿博髓演尽村捂颇豢尺迅滁料公忧痒墩第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,酶促标
24、记法（一）切口平移法（nick translation),1、利用DNase I在DNA双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,抖潦殿坛丸筋统抬期慢哮譬沙配晰恫拼强振饭辙目熔韦宽叶敛蔚柿轩箕陵第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,（二）随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核
25、苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,前阂扰点来碑婪垄料晋殆团谅守哺助稿吞痉馈水蟹帝腥谊撵饰宿硫掣驮拾第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,藩应瓷烦胚觅波坠狭喻俩衅艘贺坐树湘侄纠扼予活拼容福悲鲁倡晃控顿钢第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术
26、,（三）PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反 应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,供葬蘑什簿胡聪诡聘毯捅绘博毕侗画棉唉爽择悼吐稿霹晒宋涯捆胁扇庄滨第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,四、探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,白欣撮允服搬玄淹在奎招临神阵终碳其玄兰派簇滞非技述苏付刃党斯绚幂第十章核酸分子杂交技术第十章核酸分子杂交技术,
