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1、第八章 染色体工程,染色体变异,染色体结构变异染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。,染色体数变异一是体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；另一种是染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。,什么是染色体工程？,染色体工程（chromosome engineering）是人们按照一定的设计，有
2、计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。,人工诱导多倍体和单倍体雌、雄核发育染色体显微操作技术染色体介导的基因转移技术人工染色体,第一节 人工诱导多倍体和单倍体,多倍体（polyploid）这个名词是由Winkler（1916年）首先使用的，它是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。染色体组成多倍性现象在高等植物中相当多，但动物界的多倍体现象却少得多。自从60年代发现一种美洲角蛙是一个确定的四倍体动物以来，学者们陆续在低等脊椎动物中发现许多多倍体动物，包括鱼类、两栖类和爬行类。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所
3、以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视.,一、人工诱导多倍体,（一）、人工诱导多倍体的方法,生物学方法 动物通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。种间杂交会导致第二极体不排出，从而导致多倍体产生植物包括胚乳培养、体细胞杂交等，技术尚不成熟。雌性草鱼（2n=48）与雄性三角鲂（2n=48）杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体，其中草鱼提供了二倍数目的染色体（48），三角鲂提供了单倍数目的染色体（24）。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。,物理学方法 p152温度休克法：包括冷休克法和热休克法两种，即用略高于或略低于致死温
4、度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。此法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于养殖场大规模生产使用。水静压法：就是采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。此种方法诱导率高（90%100%）、处理时间短（35min），对受精卵损伤小、成活率高。但该法需要专门的设备水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产。,化学方法细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。其它药物：N2O 和聚乙二醇等。,（二）多倍体倍性鉴定的方法p77,间
5、接法 核体积测量法：二倍体/三倍体核体积之比为 1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳 系列生化分析：如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体。形态学检查 直接法 染色体计数：是鉴定多倍性的一个准确的直接方法。DNA含量测定：流式细胞仪,（1）多倍体育种的优势：植物：对不利环境的适应有明显优势 花大、果大，营养改善 果树可延长储存期多倍体植物的性状比原来的二倍体气孔、花、果实和种子比二倍体者为大，叶肉较厚，茎秆也较粗壮,(三)多倍体育种的重要性,动物：具有良好的生存力和生长率 利用三倍体不育，消灭昆虫多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类都具有良好的生存
6、力和生长率,（2）多倍体应用举例：新型农业食品资源 无籽西瓜：没有籽、品质好、食用方便 异源多倍体小黑麦：产量高、品质好 高品质树木培育 多倍体桑树：体细胞较大、叶肉厚、抗性强 三倍体毛白杨 水产养殖 三倍体鲍,多倍体动物的生活力及生长能力。许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良好的生存力和生长率。诱导三倍体可以增加种间杂种的成活率，三倍体种间杂种可以比二倍体杂种成活得更好一些。,多倍体动物的应用及发展趋势,多倍体动物的性腺发育及其应用 三倍体预期是不育的，许多实验也都证明了这一点。生产上可以利用这个不育特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市
7、时间或影响商品价值，也避免了生长停滞和死亡率的增高，缩短了养殖周期、减少了养殖成本，可养成大型个体。与三倍体不同，四倍体是可育的。目前如何大量诱导四倍体并培育至性成熟，尔后与正常二倍体杂交获得不育的三倍体，进行三倍体育种是许多学者正在致力研究的课题。,多倍体动物的其它经济性状三倍体虹鳟的鱼肉质量确实优于二倍体，其抗传染性造血器官坏死病毒能力较强；三倍体大西洋鲑耐低氧，故可适用于低氧环境养殖；三倍体香鱼对声音和光线的感受能力比二倍体香鱼略显迟钝，适于在噪音较大的环境中放养。,(四)、多倍育种中存在的问题,（1）需要找到更适宜的诱导剂（2）嵌合体现象还不能克服，真正同一倍性的多倍体出现的概率不是很
8、高（3）判断是否是多倍体的一些特性评价的准确性（4）在遗传上具有高度杂合性的多倍体过剩遗传信息对多倍体遗传效应的贡献有多大（5）多倍体诱导技术在育种上的应用还不完善，需要开展广泛的研究,二、单倍体育种,单倍体育种：指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原理材料.,1单倍体优点（1）由于单倍体只具有一套染色体，染色体上的每个基因都能表现相应的性状，所以极易发现所产生的突变，尤其是隐性突变，所以单倍体是研究基因或基因剂量效应，进行染色体遗传分析的理想材料。（2）由于通过人工方法
9、使单倍体的染色体加倍就可以获得纯合二倍体，在育种上具有极高的价值。,2单倍体育种的优越性（1）可以克服杂种分离的困难,缩短杂交育种时间,一般只需一年就可迅速获得自交系,两年可获得纯系。（2）大大提高选育效率。（3）能克服远缘杂交的不孕性，创造出新物种。,3人工诱导单倍体的方法 远缘杂交 标记花粉的利用 延迟授粉 核置换 射线照射 染色体有选择地消失 未授粉子房培养和花粉培养（最有效）,4小麦花药培养生成单倍体加倍植株过程（1）花粉的获得（2）花药制备与培养（3）染色体加倍获得二倍体（4）愈伤组织培养（5）移栽,第二节 雌、雄核发育,雌核发育（gynogenesis）是单性生殖的一种，指卵子依靠
10、自己的细胞核发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。雄核发育（androgenesis）是指因经过紫外线、X射线或射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。,首先将两个不同品系的近交系进行杂交。交配后，在精核与卵核尚未融合之前，从母鼠子宫内冲取受精卵，并用极细的吸管将精核去掉。在细胞松驰素B的处理下使雌核加倍，形成二倍体细胞。二倍体细胞在体外培养到囊胚期后，移植到养母的子宫内，使胚胎继续发育，直至出
11、生。,一、人工诱导雌核发育的方法,精子遗传物质的失活：物理方法：采用物理辐射如射线、X射线和紫外线等处理精子使精子的遗传物质失活。化学方法：采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。显微手术法：采用显微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。,人工诱导雌核发育的方法,雌核染色体的二倍化温度休克法流体静水压法化学试剂处理如细胞松驰素B,二、雌核发育的鉴别,形态生化细胞学,三、雌核发育的意义,为生产单性种群提供了可能 迅速产生同源型二倍体 为遗传学研究提供某些致死突变种，成为研究材料 农牧渔业中，引入单性雌体子代，可被用于筛选优质高产品系 有助于研究解决一系列遗
12、传理论上的重要问题雄核生殖二倍体研究在遗传学和育种中有价值。但研究尚未成熟，其个体生存率低,第三节 染色体显微操作技术,染色体的分离染色体的微切割,染色体分离的基本原理由于荧光染料Hoechst 只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染后，再经激光照射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染色体的分离。,细胞分裂同步处理染色体的荧光色素染色染色体的分离,染色体微切割最常
13、用的方法：微细玻璃针切割法：采用特细的玻璃针（尖端直径约为0.17m）在倒置显微镜下对目的基因所在染色体区段进行切割与分离。显微激光切割法：将染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养皿上制作，利用激光共聚焦扫描显微系统，依靠高能量激光照射非选择细胞或染色体，使其受热蒸发，最后只留下目的染色体。,第四节 染色体介导的基因转移技术,将同特定基因表达有关的染色体或染色体片段转入受体细胞，使该基因得以表达，并能在细胞分裂中一代又一代地转递下去。该技术称为染色体介导的基因转移技术，又称为染色体转导。微细胞介导的基因转移法（Microcell mediated gene transfer，MMGT）染色体介导的
14、基因转移法（Chromosome mediated gene transfer，CMGT）,微细胞介导的基因转移法,微细胞是指含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。,微细胞制备与融合,染色体介导转移法,染色体介导转移法是指分离得到相应的染色体后转入受体细胞的一种技术。染色体介导技术一般包括首先诱发细胞同步分裂，继而用秋水仙胺阻断细胞分裂于中期，再破碎细胞，通过离心收集大量的中期染色体，然后通过适当的分部或进一步的分类，即可转移到受体细胞中去。,分离染色体染色体的转移受体细胞的分离与鉴定,一、细胞同步化与染色体的分离,通常采用的是使细胞经秋水仙素处理而同步，再洗涤数次去除
15、残余秋水仙素和胰酶，然后移至低温中性缓冲液中培养；同时在缓冲液中加入己烯乙二醇可维持染色体完整性，提高钙离子浓度也可防止染色体解离。最后使细胞经注射而破碎，使染色体释放出来。,二、中期染色体的转移,中期染色体转移：分离到染色体后需要考虑如何将染色体导入受体细胞。早期实验的基因转移频率很低，仅-10-7-10-6，近年来技术上采用磷酸钙沉淀染色体，再用二甲基亚砜处理受体细胞，或采用卵磷脂与胆固醇制成脂质体包埋染色体，将染色体转入受体细胞，可是频率上升至10-5-10-4水平。,三、导入基因的受体细胞的分离与鉴定,分离：利用选择性培养基进行筛选。鉴定：,染色体转移技术的应用前景,染色体转移技术的应
16、用前景,第五节 人工染色体,染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括自主复制DNA序列（autonomously replicating sequence，ARS）、着丝粒DNA序列（centromere DNA sequence，CEN)和端粒DNA序列（telomere DNA sequence,TEL）。,将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificial minichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，
17、具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有：酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）哺乳动物人工染色体(mammalian artificial chromosome)。,基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列,人们利用这些序列构建载体,重组后的DNA以线性状态存在,这样不仅稳定,而且大大提高了插入外源基因的能力,并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体。如利用从酵母染色体上分离的ARS、CEN、TEL序列构建载体，然后用这种载体构建的染色体即称为酵母人工染色体。,酵母人工染色体的构建,是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS（Shizuya et al.1992），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和 parC）。,
