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1、下篇：动物细胞工程实践之,第五章 动物细胞染色体工程,本章主要内容,5.1 自然界的多倍体现象 多倍体、体细胞多倍体及由配子形成的多倍体、多倍体分类5.2 人工诱导多倍体动物*人工诱导多倍体的机制、诱导多倍体动物的方法5.3 单性生殖与人工诱导雌、雄核发育*高等动物的单性生殖、卵母细胞孤雌激活的机理、Hertwig 效应5.4 动物染色体结构的改造5.5 人工染色体 酵母人工染色体、细菌人工染色体、哺乳类人工染色体,理论基础：细胞遗传学,染色体工程(Chromosome engineering)-是按照一定的设计,有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。由Rich和Khush于1966
2、年最先提出,已成为细胞工程和现代遗传育种的一个重要组成部分。研究内容和应用范围：人工多倍体诱导、雌核发育、雄核发育、动物染色体结构的改造及人工染色体的构建等。（细胞遗传知识）,植物(Plant),物种 染色体数目（2n=）人 46 小白鼠 40非洲爪蟾 36蛙 26 果蝇 8线虫 2家蚕 56猪 38 马 64牛 60绵羊 54鸡 78,物种 染色体数目（2n=）拟南芥 10水稻 24 普通小麦 42 大麦 14 玉米 20 烟草 48 陆地棉 52大豆 40 西瓜 22,动植物染色体数,动物（Animal）,2个,5.1 自然界的多倍体现象,(1)多倍体（Polyploid）-指个体每个细胞
3、中含有3个或3个以上的染色体组（genome）染色体组：指配子中所包含的染色体或基因的总和。单倍体：体细胞中含有本物种配子的染色体数目的个体。根据细胞中染色体组数目的不同称为三倍体(tripliod)、四倍体（tetrapliod）、五倍体（pentapliod）等。,5.1.1 概念,为什么植物中多倍体较多、动物中较少？,-是进化的结果，是生活方式的反应。-植物:固着为生，必须耐受极端环境的改变，染色体多能增加遗传的表型易变性。-动物:可动，能避开恶劣环境生存。,多倍体多见于高等植物,如小麦、棉花、烟草、苹果、梨等，动物少见。,(2)动物中的天然多倍体,早先以为几乎所有动物都是二倍体。在20
4、世纪60年代发现一种美洲角蛙是四倍体。之后,在低等脊椎动物包括鱼类、两栖类和爬行类中也有发现；鱼类多倍体相对较多，虹鳟、鲤鱼、泥鳅和鲫鱼(Carassius auratus)等就是天然多倍体。在人类也发现有三倍体。,人类三倍体问题,有人曾报道了230例三倍体流产胎儿和33例产后幸存的三倍体婴儿临床资料。发现，三倍体胎儿都是二倍体和三倍体的“嵌合体”。一例三倍体婴儿，小头、并指、迟钝，血细胞培养几乎完全是二倍体，但原皮培养中约92%的细胞是三倍体，其余8%是二倍体。产生原因：三种情况：2个精子入卵（占66.4%）；二倍体精子与单倍体的卵受精（减数分裂过程中染色体未分离（占23.6%）；二倍体的卵
5、与单倍体的精子受精（10%）。,(3)体细胞多倍体、配子多倍体,体细胞形成多倍体原因:其一,成体体细胞在有丝分裂的过程中，染色体完成了复制，着丝点已分裂，但细胞受到外界环境条件(如温度骤变)或生物体内部因素的干扰，纺锤体形成受到破坏，以致染色体未被拉向两极，形成的染色体数目增加。如果这样的细胞继续进行正常的有丝分裂，就发育成染色体数目加倍的组织。第二,受精卵在分裂时，遇到特殊环境，会使整套染色体数目加倍。前者可造成躯体某部分的染色体数目加倍；后者可使发育的个体所有细胞中的染色体数目加倍。,由配子形成的多倍体。在配子形成减数分裂过程中，染色体没有减半，就会产生染色体数目加倍的配子。染色体数目加倍
6、的配子在受精以后会发育成多倍体。因此，多倍体可以发生在个体发育的不同阶段：或配子期、或卵裂期、或体细胞分裂期。,同源多倍体:-系指来源于同一个物种的二倍体以上的个体。成因：第一，有丝分裂异常。体细胞：在有丝分裂过程中染色体分裂而细胞不分裂，使“2n”变成“4n”。第二，减数分裂异常。配子：性细胞在减数分裂过程中染色体未发生分离，形成的配子仍是二倍体。如果2n X 2n 4n；如果2n X 1n 3n。异源多倍体：-系指来源于不同的种间或属间物种杂交产生的染色体数大于二倍体的个体。-成因：先通过种间或远缘杂交，再经染色体加倍而产生异源多倍体。,(4)多倍体分类,异倍体/非整倍体,-指某一个体在完
7、整的正常染色体中缺失或额外增加个别染色体。如果配子第一次减数分裂不正常，第二次减数分裂正常，那么某对同源染色体就会不分离而同时进入一极。导致另一极中一个配子缺少一条同源染色体，从而形成n+1和n-1两种配子。如果第一次减数分裂正常，而在第二次减数分裂异常时，就会形成n+1、n-1和n三种配子。相互受精结果：（n-1）X（n）个体（2n-1）；（n+1）X（n）个体（2n+1）；（n+1）X（n+1）个体（2n+2）。,5.2 人工诱导多倍体动物,多倍体动物生长速度快，成活率高、抗病力较强等。在理论和实践上都剌激了对多倍体研究的兴趣。人工诱导多倍体鱼类和贝类进展较快.两者均为重要的水产养殖动物，
8、体外产卵、体外受精和体外发育，实验操作简便，而且其人工繁殖技术已经比较成熟。,5.2.1 人工诱导多倍体的机制,多倍体是细胞内染色体加倍而形成的。有两条技术路线：(1)抑制第二极体的排放、或者抑制受精卵的第一次卵裂。鱼类精子入卵时相是第二次成熟分裂的中期，受精后排出第二极体。如果抑制第二极体排放，则形成三倍体（二倍体的雌原核和单倍体的雄原核融合）；在形成正常二倍体受精卵后，抑制二倍体受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体动物。,(2)抑制第一极体的排放,一般很少采取这条途径。因为鱼类卵子第一极体何时排放难以把握。但在贝类，精子入卵的时相是第一次成熟分裂的前期或中期，此时第一极体排出，容易把握。实验证
9、明，抑制第一极体排放，获得的胚胎的畸形率很高。,5.2.2 诱导多倍体动物的方法,(1)生物学方法：主要采用杂交方法，尤其通过种间杂交获得异源多倍体。刘思阳（1987）：用草鱼（2n=48）三角鲂（2n=48）F1（草鲂杂种三倍体 3n=72）可见，雌性草鱼卵子第二极体的排放受到抑制。种间杂交抑制第二极体放出的机制尚不清楚，而种内杂交时，极少有不排出第二极体的现象发生,有三种：生物学方法、物理学方法、化学方法,(2)物理学方法,温度休克法：,用略高于或略低于致死温度的冷或热休克法诱导形成3n（抑制第二极体排放）或抑制第一次卵裂形成4n。优点：廉价、易操作；常用。,成功的关键：能否阻止第二极体的
10、排出。需考虑三个因素：温度处理的开始时间（TA，从受精开始算起）、第二，处理持续时间（D）和处理时的水温（T）。影响因素很多，需要通过生物统计方法-正交试验、方差分析，以获得三因素组合的最佳值。,水静压法 采用较高的水静压（65kg/cm2）抑制第二极体的排放或抑制受精卵第一次卵裂，产生多倍体。优点：诱导率高（在90%100%），处理时间短，对受精卵损伤小，成活率高。缺点：需专用设备如水压机，成本较高，且处理卵的数量有限，不适于大规模生产。,高盐/高碱法 用高出常量浓度的盐或碱抑制第二极体的放出或受精卵第一次卵裂，产生三倍体或四倍体。,(3)化学方法,细胞松驰素B（Cytochalasin B
11、,CB）：抑制肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质分裂。鱼类上因其诱导多倍体效果不好而几乎不被采用，但却是贝类诱导多倍体的最有效的方法秋水仙素（Colchicine）:抑制细胞分裂中期纺缍丝的形成，阻止有丝分裂。源自秋水仙，极毒，处理容易形成嵌合体，且存活率低而不太常用。PEG法：用其处理虹鳟精子，精子细胞融合后与卵子受精，获三倍体。其它试剂：麻醉剂：水合氯醛、乙醚等。缺点：药品昴贵，且有毒性，影响处理后的胚胎发育，实践中应用不多。,5.2.3 多倍体倍性鉴定（直接法、间接法）,(1)测量核体积。多倍体细胞及细胞核比二倍体稍大。鱼类，测量红血球的核体积之比值方法。2n:3n=1:1.5;2n:4n=
12、1:1.74；(2)蛋白质电泳：血清蛋白，只对特定物种可用。(3)生化成分分析：三倍体具有较二倍体的红血球数量少，丙酮激酶活显著高于二倍体等。(4)染色体计数：准确，但费时。(5)DNA含量测定：流式细胞仪（Flow cytometry）简单、快速、准确测定出单细胞的DNA含量。,5.3 单性生殖与人工诱导的雌、雄核发育,在生物的体细胞中，染色体的数目不仅可以成倍地增加，还可以成倍地减少。例如，蜜蜂的蜂王和工蜂的体细胞中有32条染色体（受精的卵）；而雄蜂的体细胞中只有16条染色体（未受精的卵）。单倍体：体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体叫做单倍体。,雌蜂（n=32）,5.3.1 人工诱导雌
13、、雄核发育,(1)雌核发育-俗称假受精，指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但核并不参与卵球发育，染色体很快消失，胚胎发育仅在母体基因的控制下进行。-人工诱导雌核发育：用经过紫外线、X射线或射线等处理后的失活的精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理方法处理，以抑制卵子第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。,雌、雄核发育即单性发育。是通过人工控制产生的单性种群。意义；纯系建立、性别控制、遗传机制研究。,Hertwig(1911年)首次在两栖类蛙的胚胎获得人工雌核发育的证据。Hertwig效应：指在适当的高辐射剂量下，导致精子染色体完全失活，届时精子穿入卵内，起到激活卵球启动发育的
14、作用。,“赫特威氏效应”-Hertwig 效应,Hertwig效应实验：,-当对精子辐射剂量较少（以时间为单位），在极限以下时，受精后的胚胎都正常发育（遗传物质未受破坏，正常授精）；-随着辐射剂量的增加，胚胎存活率逐渐下降（遗传物质受到影响，精子受精异常）；-继续增加剂量，又能回复到正常卵裂并提高早期胚胎存活率（精子染色体完全失活，雌核发育成功）。-再继续增加剂量，将精子完全致死，使其丧失受精能力，卵球便绝然不能发育下去（精子失去激活卵子的能力）。,图5-2 紫外线的照谢剂量对光棘球海胆授精早期胚胎成活率的效应（高悦勉等，水产科学，2003，6：1-4）,棘皮海胆早期胚胎发育成活率印证存在He
15、rtwig效应,图5-2中可见,海胆授精率在前90min 内呈下降趋势。但在110130 m 时又略有回升,而从130 s 后随着照射剂量的增加授精率大幅度下降。早期胚胎成活率在090 m 阶段随照射剂量的加大而迅速递减。从110 m 后开始有所回升,到130 m 时达到最高值为61%；从 40180 m，实验组的孵化率均为零。显微镜观察显示，单倍体可以发育到原肠胚期，以后停止发育。,紫外线照射使染色体失活的机理-Hertwig效应原理,紫外线与DNA 作用时,在同一条多核苷酸链内相邻的胸腺嘧啶之间相互联结,形成了胸腺嘧啶二聚体(Thymine Dimers)，此种二聚体阻止了DNA 的复制,
16、从而导致了精子遗传物质失活。紫外线照射可诱发突变和切断染色体,当照射量达到一定值以上,染色体断片脱落,精核萎缩,授精后虽然雄性原核化,但不能与雌核融合,不能正常发育。但可以激活雌核发育（单倍体）；如果雌核染色体加倍，就可形成正常二倍体动物。,（2）雄核发育（androgenesis),-将经紫外线、X射线或射线等处理卵子后，与正常精子受精，再在适当时间施以冷、热、高压等物理方法处理，使精子染色体加倍与卵子结合，发育成完全为父本性状的二倍体。人工诱导雄核发育研究较少。价值不大。,5.3.3 哺乳动物雌核发育-卵子的孤雌生殖,孤雌生殖不同于雌核发育，它是在不需要同种或异种精子进入卵子，由卵子单独启
17、动胚胎发育的。哺乳类:19世纪上半叶，使兔的孤雌生殖卵发育到卵裂。迄今，人工诱导雌核发育尚有许多问题，但通过人工诱导的雌核发育的卵球，仍能跨入胚胎的早期发育阶段。,(1)卵母细胞孤雌激活类型,正常情况下，in vivo，精子入卵激活卵子。In vitro，一些人工因素也能使刚排出的M卵母细胞激活，排出第二极体、完成第二次减数分裂并继续发育。由于激活卵母细胞时所使用的剌激因素、强度、培养液的渗透压等不同，往往使第二极体排放与否不定，得到的孤雌胚（孤雌卵）的核型有以下几种：,A.第二极体排出,形成均质单倍体。B.激活卵即刻分裂形成两个均等的卵裂球，一个含有雌原核，一个含有第二极体的核，构成嵌合单倍
18、体。在完成第二次成熟分裂时，第二极体未排出。出现发下三种现象：C-异常的延迟分裂，同样构成嵌合单倍体。D-两个混合的单倍体原核组成一个二倍体，形成杂合二倍体。E-雌原核加倍，形成纯合二倍体。通常具有二倍体的孤雌胚发育较好（D，E）。,(2)哺乳动物孤雌胚的发育,小鼠：发育到11天；兔：11天；绵羊：约26天.完全的孤雌胚迄今还不能发育到分娩期。但与正常胚胎构成嵌合体后，产生出具有孤雌胚鼠特征和正常胚鼠特征的嵌合小鼠，且孤雌胚细胞能嵌合到生殖腺。,5.4 动物染色体结构的改造,通过染色体片段的删除和重排，产生携带特定染色体区片段缺失突变的动物，有助于在特定的染色体区实现系统的基因定位和功能分析。
19、,5.4.1 染色体片段的删除和重排,（1）放射线诱导发生染色体缺失突变,放射线可以使染色体产生缺失、易位、倒位、复制及基因内的点突变。Russell等(1951)年利用放射性射线在小鼠的7个显著的遗传标记位点产生突变，进行基因功能的研究。利用ES细胞诱导产生突变，再将带有突变的ES细胞植入小鼠的囊胚，从而产生带有突变的个体，进一步进行功能的研究，已成为功能基因组学研究的热点。,（2）Cre2loxP介导染色体重组,Cre重组酶是在噬菌体P1中发现的一个38kDa的蛋白质，其名称来源于cause recombination，它能识别34bp的特异序列（loxP），介导两个loxP之间的序列发生
20、重组，从而将两个loxP之间的序列删除，此过程不需要任何其他辅助因子的帮助。loxP的位置和方向不同，由Cre重组酶介导重组形成的产物亦不相同，导致染色体发生倒位、删除和易位等，从而实现染色体的定点操作。克服了用放射线诱导产生的突变不能定位的缺点，已被应用于果蝇、哺乳动物和植物染色体重组研究。,通过小鼠染色体大片段的删除和重排可以产生一些人为可见的表型。主要建立疾病动物模型来模拟人类的某些疾病，为研究肿瘤抑制基因的识别和疾病的治疗诊断找到了捷径。,染色体大片段的删除和重排的意义,5.4.2 染色体的易位（translocation）工程,家蚕的性别控制与识别在实践和理论上的都有重要意义。通过建
21、立性别标记的限性系统，可提高生产收益。性别标记的限性系统是指某一标记性状在雌、雄个体不同的遗传系统。雄蚕茧比雌蚕茧出丝率高20%以上，体质比雌蚕要强壮。养蚕生产上所用一代杂交种（大体上是雌、雄各一半），如果全是雄蚕，那么既不用增加成本，又不多费劳力就可以增加10%15%的蚕丝。,桑蚕中的W染色体具有决定雌性的绝对功能。在W染色体上，除有决定雌性的基因外，还没有发现能表现其它性状的基因，但人们可以利用、等物理射线的照射处理，能使带有标志基因的某个染色体片段易位到W染色体上，从而获得好几种限性遗传的类型.近些年来，运用辐射诱变和染色体工程手段先后培育出有性别标记的限性蚕品种。目前生产上可利用的有卵
22、色限性系，斑纹限性系和茧色限性系，卵色限性系已建立了一个较为完整的系统。,图的卵色限性系统说明：、3 分别为第二白卵基因、第三白卵基因，+、+3分别为、3的等位基因（显性），、3，同时存在表现黑卵。载有、3、+、+3的是第 10染色体。,上世纪70年代用辐射诱发了两个第10染色体向染色体易位的品系，其中一个在易位的第10染色体片段中含有白卵基因3,另一个含有白卵基因。由于+与+3 有互补作用，只有同时存在才表现黑卵，隐性或3只要任何一个成纯合型时，便表现白卵。这种易位雌体各同持有或33 的雄交配，分别得到黑色雌卵与白色雄卵，表现卵色限性遗传。当这两个品系互交时，就得到黑色雄卵和白色雌卵。采用这
23、样的品种进行原种繁育时，可由光电选卵机多选黑卵雌蚕饲养，能提高制种能力、降低生产成本。农村养蚕用两系的正反杂交F可选黑卵雄蚕饲养，以提高出丝率。,蚕卵色限性系统,5.5 人工染色体,染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配，它需要3个关键序列：其一，自主复制DNA序列（autonomously replicating sequence ARS）：是DNA复制的起点，确保染色体能够开始自我复制。其二，着丝粒DNA序列（centromere DNA sequence CEN）：确保染色体在细胞分裂时能平均分配到子细胞中。其三，端粒DNA序列（telomere DNA
24、 sequence TEL）：使DNA能结束复制，确保染色体的独立性和稳定性。,将自主复制DNA序列、着丝粒DNA序列和端粒DNA序列 这3个关键序列组装拼接后就得到人造微小染色体（artificial minichromosome）。应用：在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。,人造微小染色体的制备与应用,目前正在研究或应用的人工染色体,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome YAC）、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome BAC）哺乳动物人工染色体（mamma
25、lian artificial chromosome MAC）。,Fig.5-5 人造基因,5.5.1 酵母人工染色体（YAC）,1983年，Murray等人首次成功构建了包括着丝粒、端粒、复制子和外源DNA总长度为55kb的酵母人工染色体。1987年，Burke等人构建了能克隆大片段人体DNA分子的载体YAC。证明YAC可用来构建高等生物的完整基因组文库，克隆容量达1001000Kb。,图5-3 YAC的构建,pYAC（YAC质粒）长约8kb，带有人工染色体所需的一切元件。当要用它进行克隆时，先用BamHI和SmaI对它进行双酶解，回收两个臂，然后平末端的外源大片段DNA就可以两个臂连接，形
26、成真正意义上的人工染色体。,色氨酸合成基因,酵母菌着丝粒序列,端粒,复制原点,酵母人工染色体的构建,与其他克隆载体的构建程序相似：第一，包括大片段DNA的获取；第二，YAC重组体的构建；第三，YAC重组体对酵母的转化；第四，YAC基因库的鉴定；第五，目的基因YAC克隆的筛选；第六，目的基因YAC克隆的鉴定。,YAC存在一些缺点：,YAC是目前容量最大的载体，但存在一些缺点：-插入片段大，稳定性较差；-插入的大片段易发生缺失，使文库不完整；-插入片段易发生重排，造成序列错误；-DNA片段来自两个或两个以上的染色体，使文库中的嵌合现象严重，影响基因的分离和分析；-YAC与酵母的染色体结构极为相似，
27、从酵母细胞中难以分离。,5.5.2 细菌人工染色体（BAC）,BAC基本克服了YAC的缺点，在宿主E.coil中只有12个拷贝，在传代中插入片段不易发生变化，能稳定遗传；其转化宿主为重组缺陷性菌株，避免了嵌合现象。同时，BAC转化采用电激法，比YAC所用的PEG转化率高10100倍，因此，BAC被广泛用于150300kp以下的DNA克隆。,5.5.3 哺乳类人工染色体（YAC）,哺乳动物染色体远比酵母的染色体复杂，尤其是它们的着丝粒和动力结构也尚未完全搞清楚，还不能克隆含高度重复序列的着丝粒DNA大片段，使得哺乳动物人工染色体研究的进展缓慢。随着YAC的构建成功，许多科学家试图发展人类人工染色
28、体（HAC），借此确定人染色体成分的最小片段，从而更深入地理解染色体行为。同时，HAC可以作为有效的非病毒基因转移载体，用于基因治疗。,5.5.4 人类人工染色体的应用,（1）染色体结构与功能关系研究YAC的出现第一次证实了构建染色体的关键成分，HAC的构建将大大促进人类染色体结构与功能的研究。（2）基因治疗人类人工染色体的最大应用价值在于基因治疗。它安全、无副作用，不会像病毒载体那样产生细胞毒害和免疫原性，是基因治疗的理想载体。现在已经开展了大量的研究，但离临床应用还有很大距离。,第五章 习 题,1.多倍体？YAC？BAC？MAC？2.动物体细胞多倍体形成原因？3.同源多倍体及其形成原因？4.诱导多倍体形成有那几种方法？5.雌核发育？6.Hertwig效应？7.卵母细胞孤雌激活的机理?,
