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1、现 代 仪 器 分 析,MODERN INSTRUMENTAL ANALYSIS,Apple Lu,3 高效液相色谱分析 High Performance Liquid Chromatography,HPLC特点：经典液体柱色谱引入气相色谱法理论,高压：突出特点；150105 350105 Pa高速：20h-1h高效：GC-1000塔板/m HPLC3万塔板/m(固定相)高灵敏度：UV；AFS,HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚
2、物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子 型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,影响色谱峰扩展及
3、色谱分离的因素,3-1,H=A+B/u+Cu液体与气体的不同？,1.涡流扩散项He,He=2dp 一定,2.纵向扩散项Hd,Hd=CdDm/试样分子本身运动所引起的纵向扩散，当线速度大于0.5 时，可忽略,3.传质阻力项：主要因素,Hs=Csdf2/Ds 试样分子从流动相进入到固定液,Hm=Cmdp2/Dm,Hsm=Csmdp2/Dm,固定相传质阻力,流动相传质阻力,流动的流动相传质阻力,滞留的流动相传质阻力（传质过程中主要作用）,H=2dp+CdDm/+Csdf2/Ds+Cmdp2/Dm+Csmdp2/Dm,A,B,C,主要因素：传质相 C提高柱效有效途径：减小粒度Hmin小一个数量级柱外展
4、宽：柱前峰展宽；柱后展宽,试样注入到填料中心之内12mm 处，减少柱前扩散；,连接管的体积和检测器的死体积应尽可能小。,主要类型与分离原理,basic principle and main separating types,3-2,一、液-液分配色谱liquid-liquid partition chromatogra二、液-固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph四、空间排阻色谱size-exclusion chromatograph,一、液-液分配色谱-化学键合相色谱,固定相与流
5、动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的相对溶解度不同；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失？，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相化学键合相色谱应用最广泛）。,二、液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂 如硅胶、氧化铝等，较常使
6、用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：试样分子和流动相分子对固定相表面的竞争吸附；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,三、离子交换色谱,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复可逆离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长.阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3 M+H+阴离子交换
7、：RNR4OH+X-=RNR4 X+OH-,离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据不同离子对交换剂具有不同亲和力实现分离。,离子色谱法（IC）,离子交换的基础上发展而来。水溶液中阴离子分析的最佳方法。固定相：离子交换树脂流动相：电解质溶液,“用电导检测器对阳离子和阴离子混合物作常量和痕量分析的色谱法。分析时在分离柱后串接一根抑制柱，来抑制流动相中的电解质的背景电导率”,空间排斥（阻）色谱Size Exclusion Chromatography,M.W.,tR,四、排阻色谱色谱：不以相互作用力差异进行分离,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分
8、子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰？；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,排阻色谱法不能用来分离大小相似、相对分子质量接近的分子只能分离相对分子质量差别在10%以上的分子可测定高聚物的相对分子质量的分级情况,一、液相色谱固定相stationary phase of HPLC二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC,液相色谱的固定相与流动相,stationary phase and mobile phase of H
9、PLC,3-3,一、液相色谱固定相 stationary phases of LC,1.液-液色谱及键合相色谱固定相（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的nm级硅胶微粒堆积而成的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；,（3）化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
10、c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510 m；,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换
11、键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,4.空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC,1.流动相特性（
12、1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3.
13、流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂
14、破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,思考题：1.正相色谱2.反相色谱3.化学键和固定相4.洗脱剂及其作用,离子对色谱,强极性有机酸、有机碱的分离分析,将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱的分离,
