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1、酶工程Enzyme Engineering,第一章 绪 论,第一章 绪 论第一节 酶的基本概念第二节 酶工程发展概况第三节 酶的生产方法和应用,第一节 酶的基本概念 一、人们对酶的认识和酶的 生物学意义 二、酶的催化特性 三、酶的分类与命名 四、酶活力的测定,一、人类对酶的认识及其生物学意义 人们对酶的认识最早起源于酿酒、造酱、制饴和治病等生产与生活实践,中国 我们的祖先在几千年以前就已经开始利用酶：夏禹时代，人们就会酿酒；“周礼”上也已有造酱、制饴的记载；春秋战国时期，已采用曲治疗消化 不良等疾病的案例。当然，在那个时代，我们祖先对酶还是缺乏认识。,西方 随着人们对酿酒发酵过程研究的深入，从
2、19世纪起对酶的认识也逐渐深入。,1810年Jaseph-Lussac发现：酵母可将糖转化为酒精,酶的现代史可以追溯到1833年1833年,佩恩(Payen)和帕索兹(Persoz)首先发现酶；,1833年,他们在Annales de Chemie et de Physique期刊发表文章 文章中,法国化学家Anselme Payen和Jean-Franois Persoz描述了从大麦的麦芽中分离淀粉酶多聚体的过程，并将之命名为淀粉酶。和麦芽一样，该产物将糊化淀粉转变成糖，主要是麦芽糖。,1835年瑞典的Jns Jacob Berzelius 首次证明了用麦芽提取物可以比硫酸更有效地降解淀粉，
3、并将这一过程称为催化。,1836年德国生理学家Theodor Schwann 在研究消化过程时，分离出一种在胃内消化蛋白的物质，将它命名为胃蛋白酶。这是第一个从动物组织中提取到的酶。,在对酶的认识上还存在着一段长达60年关于酵母的争论,1839年，德国化学家Jutus von Liebig建立了一个模型来阐述酵母在发酵过程中的作用。他把在发酵混合液中的酵母看作一个能产生震荡的分解物质：蔗糖原子经过重排，变为酒精和二氧化碳。,Liebig首次认为发酵现象是由于酵母细胞中含有发酵酶，是发酵酶催化糖发酵产生酒精。但由于当时科学和技术的限制，他未能从酵母细胞中制备出可催化发酵的无细胞酶制品。,而到18
4、58年，法国化学及生物学家Louis Pasteur用一系列文章证明发酵仅在活体细胞状态下才会发生即是与生命相关的现象Louis Pasteur视其为一种生理活动。,对酵母在发酵过程中作用机理的分歧，引发了Liebig和Pasteur之间的激烈争论。直到Liebig和Pasteur先后于1873年和1895年去世，争论仍未结束。,1897年，德国化学家Eduard Bchner 和 Hans Bchner（常称Bchner 兄弟）发现一种离体酵母提取物可以使酒精发酵，即酵母细胞产生一种酶，这种酶引起发酵。,证明离体酵母提取物可以象活体酵母细胞一样将葡萄糖转变为酒精和二氧化碳。换句话说，这一转变
5、并不依赖于酵母细胞，而是依赖于无生命的酶。,Buecher兄弟结果的意义从实验上说明了发酵与细胞的活力无关表明了酶能够以溶解的、有活性的状态从破碎的细胞中分离出来，,推动了酶的分离以及对酶 的理化性质的进一步探讨 和研究促进了各种与生命活动过 程有关的酶系统的深入研 究,至此，Liebig和Pasteur之间的争论就最终得到解决。Bchner兄弟也由此奠定了现代生物化学的基石。,从此时开始，人类对具有生物催化的酶有了一个较为清晰的认识,1876年，William Kuhne提议用新的术语-酶（enzyme）来表示未统一名称的已知的各种酵素。如从活体组织中提取的酵素等。enzyme本身的意思是“
6、在酵母中”，起源于希腊语，其中en表示“在之内，zyme-表示酵母或酵素,此外还有一些划时代的事件：1913年，Leonor Michaelis和Maud Menten提出了描述酶反应速率和底物浓度之间关系的动力学模型；1926年，Sumner第一次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明酶具有蛋白质性质；,1930年，Northrop分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶及凝乳蛋白酶，并进行了动力学探讨，确立了酶的蛋白质本质。,1982年，Thomas R.Cech等发现核糖核酸(RNA)也具有催化活性。,酶的生物学意义和应用,从微生物到植物再到人，酶是所有有机体体内的组成成分。,1 酶无所不在,！人、动物、植
7、物以及细菌、真菌等 微生物的体内都有酶。！酶是自然界的工具，它们剪切、拼 接营养物质等。！酶催化所有生物体必需的代谢活 动；比如，在胃内，酶将食物消化 为极小的颗粒，以易于转化为体内 的能量。,可以这样说，在生物有机体内每当物质需要由一种形式转化为另一种形式时，酶都可以起催化作用促使反应加速。,生命活动,生化反应,在酶的催化作用下,生物体内，组成生命活动的大量生化反应都是在酶的催化作用下得以有序而顺利地进行，进而保证了正常代谢途径的畅通而不发生副反应，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关,酶是一类生物催化剂，其化学本质为蛋白质,可以这样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动,食物从
8、口腔到肠道的过程中，不同的酶作用于食物的不同成分，将其分解。,没有酶，即使你用金卡，在最好的饭店中用餐，也会饥饿而死。,2 酶可分解食物,3 酶是生物体自身的工程师,酶能将生物物质切割为小的碎片，再将其重新连接起来。这样酶在我们的身体内分解或合成所有生命必需的物质。,4 每一种酶都有其特定的功能,酶的一个很独特的性质是，每种酶只催化一种反应或者其逆反应。底物与酶象钥匙与锁一样配套。只有当酶找到其合适的底物时，生化反应才会发生。,5 酶可以被完全生物降解,使用化学制剂会对环境产生危害；而酶可以更经济地完成同样的工作，却对环境无害。自然界有很多微生物可以轻易地将酶分解为单个的氨基酸，这些氨基酸又可
9、以用于周围生物体的生长。为解决工业污染问题提供了最佳方案。,6 酶是工业问题的自然解决方案,化学制剂用于纺织业生产。如果改用酶，就没有化学制剂所带来的危险，而且生产过程中产生的污水更少。,6 日常生活离不开酶,在洗涤剂、纺织、食品和饲料工业等许多行业中，酶已经使用了50多年。在这些工业中，酶取代了化学制剂，节约了水、原材料和能源。,人类对酶的化学本质的认识 历史上对酶的化学本质的认识也经历了一个曲折的过程,自从人类对酶的催化作用有了认识以后，一直到上世纪初，对酶的化学本质认识都存在争议，主要是酶的化学本质是什么没有一个统一的认识。,上世纪20年代初，著名学者Richard Willstatte
10、r认为酶是非蛋白质，并开展大量的研究试图证明他的观点,Willstatter的实验 Willstatter将过氧化物酶纯化了12000倍后，酶的活性很高，但却检测不到蛋白质,Willstatter的结论 Willstatter错误地认为酶是由活动中心与胶质载体组成，活动中心决定酶的催化能力及专一性，胶质载体的作用在于保护活动中心，蛋白质只是保护胶质载体的物质 以此来解释酶纯度越高越不稳定的实验事实。,观点错误的原因 由于当时蛋白质的检测水平的限制而产生后果：但由于Willstatter的权威地位，使这一观点在当时较为流行,1926年Sumner第一个通过分离和结晶得到了脲酶 提出了酶是由蛋白质
11、组成的观点,直到Northrop和Kunitz得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶的结晶，并用相关的实验方法 证实酶是一种蛋白质此后，酶的蛋白质属性才普遍被人们接受。,迄今为止，所发现的酶已经超过4000种，而这些酶都是由生物体自然产生的具有催化能力的是蛋白质,值得指出的是，近年来，核酶、抗体酶、模拟酶或人工酶的发现，对酶的化学本质的传统概念提出了挑战,酶的定义：酶是由活细胞产生的，在细胞内、外一定条件下都能起催化作用的具有高效率和高度专一性的一类特殊蛋白质，酶能在机体内十分温和的条件下高效率地起催化作用，使得生物体内的各种物质处于不断的新陈代谢中。,一个氨基酸残基的-羧基与另一氨基酸残基
12、的-氨基之间的酰胺键,不分枝的一条或多条多肽链组成,蛋白质,酶（酶的化学本质）,酶的化学本质,酶,1 蛋白质（单一）,2蛋白质+其他,辅助因子,辅酶,酶的两种形式,酶的组成,一.酶的化学组成 1.单成分酶（单纯蛋白质/简单蛋白质）2.双成分酶（结合蛋白质）(1)蛋白质部分（酶蛋白）稳定辅因子(2)非蛋白质部分（辅因子）起催化作用 小分子有机化合物 金属离子 全酶=酶蛋白+辅因子,辅基/辅酶和维生素,1.维生素的概念 脂溶性维生素：A(视黄醇)D E(生育酚)K维生素 硫辛酸（氧化型）水溶性维生素：Vc（抗坏血酸）VB:B1(硫胺素)B2(核黄素)B3(泛酸)B5(PP)B12（钴胺素）B6(吡
13、哆醇/醛/胺）B7(生物素）硫辛酸（还原型）,2.辅基辅酶在酶促反应中的作用传递电子、原子或某些基团,传递氢的辅基/辅酶 1.辅酶I/辅酶II及维生素PP 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/CoI）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP/CoII）NAD+（NADP+）NAD(P)H+H+,+2H+,2e,-2H+,2e,2.黄素核苷酸和维生素B2(1)黄素单核苷酸（FMN)(2)黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)FMN（FAD)FMNH2（FADH2)3.维生素C（抗坏血酸）4.泛醌（辅酶Q)5.谷胱甘肽 2GSH GSSG,+2H+,+2e,-2H+,-2e,-2H,+2H+2H+,+2H,二.传递电子
14、的辅基铁卟啉 Fe 3+Fe 2+三.转移基团的辅基/辅酶1.传递磷酸根的辅酶腺苷磷酸酯(ATP/ADP/AMP)转移磷酰基 ATP+S ADP+P-S 转移糖基 ATP+糖-P ADP-糖+PPi 转移AMP ATP+FMN FAD+PPi 转移腺苷 ATP+Met+H2O 腺苷-Met+PPi+Pi 能量的载体 ATP+H2O ADP+Pi,+e,-e,三.转移基团的辅基/辅酶2.脱羧的辅酶硫胺素焦磷酸（TPP)硫胺素+ATP TPP+AMP3.转移酰基的辅酶（1）辅酶A和泛酸 CoA-SH+RCOOH CoA-S-COR+H2O CoA-S-COR+底物 底物-COR+CoA-SH（2）
15、硫辛酸和VB1,mg,硫胺素激酶,4.转移氨基的辅酶和VB6 磷酸吡哆醛（PLP)/磷酸吡哆胺(PMP)AA 酮酸 PCHO PCH2NH2 5.固定CO2的辅酶生物素(VB7、VH）6.转移一碳基团的辅酶(1)四氢叶酸（FH4)(2)钴铵素(VB12),酮酸,AA,酶活性中心示意图,酶的活性中心,酶分子中的氨基酸残基,辅酶或辅助因子或它们的部分结构,酶的活性中心构成,酶的结构,二级结构,三级结构,一级结构,四级结构,酶的结构,酶的一级、二级、三级和四级结构示意图,酶的空间结构,四级结构,三级结构,二级结构,酶的空间结构,酶的一级结构,酶分子中氨基酸的排列顺序。,酶的化学结构,酶的一级结构,酶
16、的二级结构,多肽链主链原子的局部空间排列,酶的二级结构,没有考虑到它的侧链的构象或与其它部分的相互关系,螺旋结构,-折叠,酶蛋白的-螺旋结构,酶蛋白的折叠结构,由-螺旋、折叠和随机结构构成的溶菌酶的空间结构,酶的三级结构,指单一的多肽链或共价连接的多肽链中，所有原子在空间上的排列,酶的三级结构,在二极结构的基础上，肽链通过进一步转曲折叠而成,酶的四级结构,各亚基在寡聚酶中的空间排布及其相互作用,不考虑亚基的内部几何形状,酶的四级结构,酶的四级结构,亚基,组成酶蛋白四级结构的最小单位,每个亚基的三维结构仍被看成是它的三级结构,疏水键,离子键,维持酶蛋白四级结构的主要作用力,单体酶,酶的存在类别,
17、寡聚酶,多酶融合体,多酶复合体,单体酶,一条肽链组成,单体酶,分子量通常在35 kDa以下,不含四级结构,单体酶的种类很少，一般多是催化水解反应的酶，绝大多数单体酶只表现一种酶活性,寡聚酶,两个或两个以上亚基组成,寡聚酶,分子量一般高于30 kDa,含四级结构,相当数量的寡聚酶是调节酶，其活性可受各种形式的灵活调节，在调节控制代谢过程中起着非常重要的作用,构成寡聚酶的亚基可以是相同的，也可以是不同的，亚基与亚基之间一般是以非共价键、对称的形式排列,寡聚酶,多酶复合体,两个或两个以上的酶,多酶复合体,靠共价键连接,一个酶催化一个反应，所有反应依次连接，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分，由于这一
18、连串反应是在一高度有序的多酶复合体内完成，反应效率非常高,多酶复合体,酶2,酶3,酶1,酶4,酶6,酶5,二、酶的生物催化特性,与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）,酶1,酶2,酶4,酶5,酶3,与一般的化学催化剂相比较，酶既拥有一般催化剂的共性，又有特性,酶催化作用的特点,加快反应速度,降低反应的活化能,不改变反应性质,反应前后其数量和性质不变,催化效率高,专一性强,反应条件温和,酶的催化活性受到调节和控制,共性,特性,酶催化作用的特点,极高的催化效率,2H2O2 2H2O+O2,Fe2+作为催化剂催化效率为610-4 mol/(mol.
19、s),过氧化氢酶，催化效率为6106 mol/(mol.s),过氧化氢酶比Fe2+的催化效率要高出1010倍,酶的催化效率相对其他无机或有机催化剂要高1061013倍,例子,高度专一性,酶对它所作用的底物有严格的选择性，一种酶只能催化某一类，甚至是某一种物质起化学反应,酶的专一性,底物专一性,反应专一性,立体异构专一性(手性、区域),从根本上保证了生物体内为数众多的各种各样的化学反应能有条不紊地协同进行,高度专一性,酶催化专一性作用机制假说,锁钥假说,诱导契合假说,酶的催化作用机理,一.中间产物学说二.酶作用专一性机理 1.锁钥学说 2.诱导契合学说酶受底物诱导而变形 3.张力学说（应变效应）
20、底物变形以适应酶三.酶作用高效性机理-影响酶高效性的因素 1.邻近定向效应 2.应变效应 3.亲核催化/亲电催化（共价催化）4.酸碱催化 5.微环境的影响,酶催化作用的中间产物学说,E+S ES P+E（酶）底物）（中间物）（产物）（酶）中间产物存在的证明：H2O2+过氧化物酶（H2O2 过氧化物酶）（褐色）（红色）645587548498nm 561550nm（H2O2 过氧化物酶）+AH2 过氧化物酶+A+2H2O（红色）（褐色）,锁 钥 学 说,诱导契合学说,邻 近 定 向 效 应,反应条件温和,温和的反应条件,常温,常压,接近中性的pH值,不需要耐高温、高压以及耐强酸、强碱的反应器,酶
21、催化机理实例胰凝乳蛋白酶,1.胰凝乳蛋 白酶结构,2.胰凝乳蛋白酶的电荷接力网,3.胰凝乳蛋白酶的催化过程,A.酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）,B.形成四联体过渡态中间物,E.形成包括水分子的四联体过度中间物,F.羰基产物形成，酶游离,酶催化活性的调控机制,酶的调控方式,抑制剂调节,反馈调节,酶原激活,激素控制,调节酶的活性、酶量来控制代谢速度，以满足生命的各种需要和适应环境的变化,酶的催化功能,降低化学反应的活化能,中间络合物学说,底物,酶,“底物+酶”中间络合物,产物,酶,可靠的实验证实中间络合物的存在,酶的催化中心,酶的催化活性集中的区域,酶的催化活性中心,与底物结合的结合中心,促
22、进底物发生化学变化的催化中心,决定了酶的专一性,决定了酶催化反应的性质,活性中心,酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或这些残基上的某些基团,辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构,不需要辅酶的酶,需要辅酶的酶,一级结构上可能相距甚远，甚至是位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近,活性中心,酶原,在细胞内合成完毕后并不表现出催化活性一些酶,酶原,有催化活性的酶,酶原的激活,通过去掉分子中的部分肽链段，引起酶分子空间结构的变化，从而形成或暴露出催化活性中心,酶原-酶关系 例子,酶的催化作用机制,酶的催化作用机制,邻近和定向效应,酸碱催化,张变、扭曲效应,共价催化,多元
23、催化与协同效应,静电催化、微环境效应等,三酶的命名和分类,2-根据酶所催化的反应性质,酶学研究早期，无系统的命名法则,1-根据酶的作用底物命名,淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,氧化酶,还原酶,转氨酶,1,2,结合法,胆固醇氧化酶,醇脱氢酶,谷丙转氨酶,来源,心肌黄酶,胰蛋白酶,缺点,缺乏系统性，常常会不可避免地出现一酶数名或一名数酶的混乱情况,国际生物化学联合会International Union of Biochemistry 简称IUB,1961年提出,1965、1972、1978、1984修改、补充,系统命名法,国际分类法,酶,1-氧化还原酶类,2-转移酶类,3-水解酶类,6-合成酶类,5-异
24、构酶类,4-裂解酶类,1 国际系统分类法,氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,氧化-还原酶 Oxidoreductase,水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,水解酶 hydrolase,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如,谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,转移酶 Transferase,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆
25、反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。,裂合酶 Lyase,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。,异构酶 Isomerase,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=A B+ADP+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2+ATP+H2O 草酰乙酸+ADP+Pi,合成酶 Ligase or Synthetase,核酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中
26、的磷酸酯键的水解及其逆反应。,核酶（催化核酸）ribozyme,EC命名法,EC为酶学委员会Enzyme Commission,亚亚类下的具体的个别酶的顺序号,各亚类下的亚亚类,酶所属大类16,大类下的亚类,x,y,z编号中的前三个数字表明了该酶的特性如反应物的种类、反应的性质,2 国际系统命名法,酶,系统名称,习惯名称,国际系统命名法,XY,正反应、逆反应都用同一名称,催化的反应名称,底物名,底物1:底物2,ATP:己糖磷酸基转移酶,DH2+NAD+D+NADH+H+DH2NAD+氧化还原酶,各大类酶的特殊命名规则,氧化还原酶往往可命名为供体受体氧化还原酶，,转移酶为供体受体被转移基团转移酶
27、,值得注意的是来自不同物种或同一物种的不同组织或不同细胞器的同一种酶，虽然他们催化同一个生化反应，但它们本身的一级结构可能并不相同，命名也有所区别,CuZn-SODMn-SODFe-SOD,CuZn-SOD,牛细胞CuZn-SOD,猪细胞CuZn-SOD,SOD,讨论一个酶时，需要说明来源和名称,四、酶活力的测定,酶活力，也就是酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。（可以根据需要定义）酶促反应速度，单位是：浓度/单位时间酶促反应速度曲线：,1、酶活力测定方法,步骤：（1）配制底物溶液（2）确定反应条件（3）反应开始，记时间（4）测定产物的生产量或底物的减少量,2、酶活力单位,酶活力的高低，是以
28、酶活力单位数来表示。1个活力单位：在特定条件下，每1min催化 1mol的底物转化为产物的 酶量。比活力：在特定条件下每1mg酶蛋白所具有的酶活 力单位数。即酶比活力酶活力mg酶蛋白,3、固定化酶的活力测定,固定化酶：与水不溶性载体结合，在一定范围内其催化作用的酶。其活力测定方法：（1）振荡测定法（2）柱法测定（3）连续测定（4）固定化酶的比活力测定（5）酶结合效率与酶活力回收率的测定（6）相对酶活力测定,一、酶工程是生物技术的重要组成部分二、酶工程的研究内容三、酶和酶工程研究的重要意义四、酶和酶工程研究进展,第二节 酶工程发展概况,一、酶工程是生物技术的重要组成部分,酶工程与发酵工程、基因工
29、程和细胞工程具有密切的联系，相互依存，相互促进，构成完整的生物技术。常规菌（或常规细胞株）改造物种 生物工程（学）工程菌（或工程细胞株）商品生产 大量生产：经济效益、社会效益、生态效益,基因工程、细胞工程,发酵工程、酶工程、生物反应器工程,酶工程与发酵工程、基因工程和细胞工程的关系,基因工程,发酵工程,酶工程,酶,细胞工程,酶,细 胞,菌体细胞,固定化菌体细胞,转基因动物,转基因植物,生物技术的四大支柱,二、酶工程的主要研究内容,酶工程是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新兴的技术科学。研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理论与技术方法。,酶工程,酶工程是酶学与工程学相互渗透、结合并发展而
30、形成的一门新的技术科学,从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应的原料转化为有用物质的技术,酶学,工程学,酶工程的定义,酶工程的内容,酶工程,酶的生产,酶与固定化酶的应用,酶的分离纯化,酶的固定化,酶及固定化酶的反应器,按1971年第一届国际酶工程会议,酶工程的内容,酶工程,酶的大批量生产、应用,酶的分离纯化,酶的固定化和固定化酶反应器,新酶的开发和应用,按现在的观点,遗传修饰酶的研究,抗体酶、核酸酶的研究,酶生产中基因工程,酶分子改造与修饰,酶的结构与功能关系,模拟酶、合成酶以及酶分子的人工设计,有机介质中酶反应的研究,酶的抑制剂、激活剂,三、酶和酶工程研究的重要意
31、义,有助于阐明生命的本质和活动规律；为催化剂设计，药物设计及疾病诊断治疗提供依据和新思路；蛋白质和核酸一级结构测定和基因工程研究中的重要工具；运用酶技术生产有重要价值的产品；运用酶技术改进生产工艺，提高产品质量和产率，降低生产成本；酶技术应用于疾病诊断治疗和环境保护等。,四、酶和酶工程研究进展,酶的应用研究 20世纪50年代：大规模的酶工业化生产建立；60年代：酶固定化，酶分子化学修饰，酶电极 问世，酶标免疫技术建立；70年代：微生物细胞固定化；80年代：动植物细胞固定化；近年来，抗体酶，人工酶和模拟酶研究。,酶的理论研究新酶的发现和鉴定酶一级结构与活力的关系酶分子高级结构的测定酶活性部位结构
32、与催化机理核酶的发现（ribozyme),化学修饰法是研究酶一级结构与活力关系的主要方法之一，近年来发展了一些新的研究技术：过渡态类似物技术；自杀性底物技术；基因定位突变技术；计算机模拟技术等。,一部分酶的高级结构已经被测定，但绝大多数酶的高级结构仍没有确定。X-射线晶体结构分析仍然是十分有效的方法；近年来，二维核磁共振技术的应用越来越广泛，可用于测定溶液中酶分子的构象及其变化过程。,酶活性中心结构及其催化机理的研究是酶学研究中最核心的问题。应用X-射线晶体结构分析技术研究酶-底物（底物类似物）复合物结构，可以确定酶活性部位结构以及酶分子与底物分子的结合情况；应用二维核磁共振技术可以确定酶活性
33、部位解离基团的pK值以及催化过程中的质子转移情况；电子计算机编程研究酶促反应动力学，对酶与底物的作用方式以及底物反应过程中酶分子的可能存在形式作出判断；应用隧道电镜技术可以观察酶催化过程中质子转移和电子转移的情况,近年来，发现生物体中的一些RNA具有催化作用，具有酶的类似性质，可以切割特异性RNA序列。这一重大发现对于生命的起源和生物进化研究；对于病毒和肿瘤的治疗将具有深远意义。,第三节 酶的生产方法和应用前景,一 酶的来源和生产,酶,植物,动物,微生物,酶的来源,动植物,粗品酶,纯酶,早期酶的生产,分离,纯化,木瓜,木瓜蛋白酶,菠萝,菠萝蛋白酶,例1,例2,生产周期长,来源有限,地理、气候和
34、季节影响,技术、经济以及伦理,动植物原料的特点和不足,不能满足要求,？,酶的化学合成,中国科学家1964年,Gutte和Merrilield1969年,胰岛素,核糖核酸酶,化学合成法,经济,试剂,设备,可行性？,微生物发酵法,微生物,酶,微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全，几乎所有的酶都能从微生物中得到,微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过控制培养条件来提高酶的产量,微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的产酶高的菌株,优点,商品酶的主要生产方法,微生物发酵法,高产优良菌株,培养和繁殖,代谢和积累,分离和纯化,酶制剂,酶的发酵生产技术,放
35、线菌 1887年以后，Bucher发现酶的细胞外作用现象，从而导致了酶的商品化生产。,霉菌 最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等。之后，Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破，其方法至今仍被采用,第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。,Pilot Biostat UD50,20世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达。由于在发酵过
36、程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程发酵工艺先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。,霉菌,二 酶工程的应用,酶可使清洁燃料的梦想变为现实,成功的饲料用酶，如植酸酶可减少向环境中排放磷,纺织精炼用酶,洗涤剂酶,酶增强牙膏的洁净能力,使用酶生产没有反式脂肪酸的食用油和奶油,提高啤酒质量,酶替代面包中的乳化剂、改善面包质量、延长保鲜期,改善面条的咬劲，增白、增亮、护色，提高面条的耐煮性并降低黏度等,烘焙工业用酶,用酶处理皮革可减少化学品的使用,促进草皮生长的产品,酶与人类的生活,酶工程的应用,酶,专一性强,反应条件温和,催化效率高,工艺简单生产成本较低,环境污染小,可生产出化学法无法生产
37、的产品,工业,农业,环保,医药,食品,纺织,酶催化的优点,应用范围,酶工程的应用,-淀粉酶,葡萄糖淀粉酶,纤维素酶,果胶酶,脂肪酶,枯草杆菌等,根霉、黑曲霉等,绿色木霉等,木质壳霉等,黑曲霉等,织物退浆、液化淀粉等,制造葡萄糖，发酵工业糖化剂,饲料添加剂，水解纤维素制糖,果汁澄清、果实榨汁等,消化剂、油脂加工、催化等,水解酶,来源,用途,酶工程应用例子,果葡糖浆的生产,42%果糖,果葡糖浆（高果糖浆）,58%葡萄糖,目前产量在700万吨以上,酶工程应用例子,淀粉乳（3540%固形物）,液化糖液,-淀粉酶,糖化液,糖化酶,精制糖液,浓缩糖液,果葡糖浆,脱色,浓缩,葡萄糖异构酶,果葡糖浆的生产也是
38、酶工程在工业生产中最成功、规模最大的应用,脱色、离子交换净化,浓缩,酶工程应用例子,5-复合单核苷酸,核糖核酸(RNA),腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷的单磷酸化合物,5-磷酸二酯酶,治疗5-复合单核苷酸白血球下降、血小板减少及肝功能失调等疾病,固定化酶法生产5-复合单核苷酸,酶工程应用例子,RNA溶液,转化液,浓缩液,固定化5-磷酸二酯酶,吸附柱,浓缩液,5-复合单核苷酸注射液,717树脂,洗脱、浓缩,过滤除菌、灌封、灭菌,活性炭过滤,配料,浓缩,酶工程应用例子,固定化酶法生产L-氨基酸,L-氨基酸,医药,增味剂,畜禽的饲料,制造人造纤维、塑料等,L-氨基酸的应用范围,酶工程应用例子,L-氨基酸,直
39、接提取,发酵法,化学合成法,外消旋氨基酸,化学法,物理化学法,酶法,拆分,酶法最为有效，能够生产纯度较高的L-氨基酸,酶工程应用例子,酶法拆分DL-氨基酸生产L-氨基酸,RCHCOOH NH-CO-R,H2O,RCHCOOH NH-CO-R,RCHCOOH NH2,N-酰化-DL-氨基酸,L-氨基酸,N-酰化-D-氨基酸,消旋酶,氨基酰化酶,1969年首次连续化拆分酰化-DL-氨基酸,酶工程应用例子,诊断和治疗疾病,诊断,乳酸脱氢酶,碳酸酐酶,谷草转氨酶,淀粉酶,诊断癌症、肝病、心肌梗死,坏血病、贫血等,肝炎、心肌梗死等,胰腺炎等,酶,可诊断相关疾病,酶工程应用例子,诊断和治疗疾病,治疗,淀粉
40、酶,蛋白酶,溶菌酶,尿激酶,消化不良、食欲不振等,消化不良、食欲不振等,手术性出血、咯血、鼻出血等,心肌梗死等,酶,可治疗相关疾病,酶工程应用例子,半合成抗生素的生产,青霉素,头孢霉素,6-氨基青霉烷酸（6-APA）,7-氨基青霉烷酸（7-APA）,新型青霉素,新型头孢霉素,几十种半合成青霉素或头孢霉素,酶工程应用例子,生物传感器,用生物活性物质做敏感器件,配以适当的换能器,生物传感器,酶传感器,微生物传感器,免疫传感器,组织传感器,场效应晶体管生物传感器,发展非常迅速,问世最早、成熟度最高的一类生物传感器,酶工程应用例子,利用酶的催化作用，在常温、常压下将糖类、醇类、有机酸、氨基酸等生物分子
41、氧化或分解，然后通过测定与反应有关的物质浓度,酶传感器,推出相应的生物物质浓度,间接型传感器,酶工程应用例子,葡萄糖传感器,最为成熟的传感器,酶传感器,研制成功的酶传感器大约有几十种,葡萄糖氧化酶,氧电极测定氧浓度的变化,葡萄糖的浓度,酶工程应用例子,光学活性化合物（手性药物）的制备,酶催化光学活性物质的合成和拆分,合成：将有潜在手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的光学活性物质,拆分是利用酶能催化外消旋化合物的不对称水解或其逆反应，从而将对映体分开,难题,高对映体选择性、副反应少、产物光学纯度和收得率高,普萘洛尔、还氧丙醇、布洛芬等手性药物的拆分,作业题：,1、名词：酶(enzyme)、酶工程(enzyme engineering)、固定化酶(immobilized enzyme)、酶活力单位、酶的比活力2、什么是酶的专一性？3、简述酶的分类和命名规则。4、简述酶活力测定的步骤。5、简述固定化酶的活力测定方法有哪些？6、酶的生产方法有哪些？7、酶工程的研究内容有哪些？,
