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1、生物制品分析概论Biopharmaceutical Analysis,【基本要求】,1了解生化药物和基因工程药物定义、种类和特点。2熟悉该类药物的质量检验的基本程序与方法。3掌握常用的定量分析方法中的色谱分析法。,返 回,2005年版药典分为几部？每部的收载内容？第一部：收载中药材及饮片，植物油脂和提取物，成方制剂和单方制剂第二部：收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品及其制剂第三部：生物制品和中国生物制品规范，101种,化学药物 Chemical drugs生物药物 Biopharmaceuticals中药 Traditional Chinese Medicine TCM,第一节：概述,
2、生物药物：是指利用生物体、生物组织或器官等，综合运用生物学、生物化学、免疫学和药学等原理与方法制得的一类药物。,生化药物 Biochemical drugs生物合成药物 Biosynthetic drugs生物制品 Biological products,生化药物：生化药物是指从动物、植物及微生物中提取的,或采用生物化学合成和现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解产物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质等。,生物合成药物：利用现代生物技术研制的一类药物，包括基因工程药物。基因工程药物：在确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，进而控制该蛋白质合成过程的基因进行分离、纯化或
3、人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因导入可以大量生产的受体细胞中，在受体中不断繁殖和表达，进而生产大规模具有复方和治疗疾病的蛋白质。,生物制品：是应用普通的生物技术获得的微生物、细胞及组织等生物材料制备用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。,生化药物和基因工程药物的分类,生化药物,氨基酸、多肽和蛋白质酶和辅酶类多糖类脂质类药物核酸及其降解产物,基因工程药物,激素和神经递质类 胰岛素、生长激素细胞因子类 人干扰素、人白细胞素、促红细胞生成素酶及凝血因子类 单克隆抗体、基因药物、反义核酸,生物制品的种类和特点,1、疫苗类药物：细菌疫苗、病毒疫苗、联合疫苗、多价疫苗2、抗毒素及抗血清类药
4、物：被动免疫制剂3、血液制品4、重组DNA制品：细胞因子、生长因子、酶、抗体5、诊断制品 6、其他制品,生化药物和基因工程药物的特点,都是来自生物体或通过生物手段获得,分子量都较大 几十KD几千KD，不是固定值,化学结构式难以确认，单单是光谱分析方法难以进行,在生产过程中需要全面的质量控制,在生产过程中要求进行生物活性检查,往往需要进行安全性检查 热源、过敏、异常毒性、致突变、生殖毒性,往往需要进行效价（含量）测定,生化药物和基因工程药物质量检验的基本程序于方法,鉴别试验,杂质检查,安全性检查,效价测定,鉴别试验,理化鉴别试验 化学反应法 光谱鉴别法UV 色谱鉴别法HPLC生物化学鉴别法 酶法
5、 电泳法 等电点聚焦法生物鉴别法,对比吸收光谱和特征吸收的一致性,对比色谱保留行为的一致性,第二节：鉴别实验,链激酶,理化鉴别,高效液相色谱法：1、反相高效液相色谱法2、分子排阻色谱法毛细管电泳1、毛细管区带电泳CZE,重组人粒细胞集落刺激因子的肽图分析,1、RP-HPLC条件：Vydac C18(150 4.6,5m)MP:0.1%CH3CF3-CH3CN in gradient elutionFR:0.5 ml/minDW:214 nm,2、CZE条件：毛细管柱（37 cm75 m），有效长度：30 cmBuffer:0.05 mol/l的磷酸盐水溶液（pH=5.8)运行电压：12 KVD
6、W：214 nm,生化鉴别,杂质检查,特殊杂质检查安全性检查,第三节：杂质检查,特殊杂质检查,1、宿主细胞蛋白残留量的检查目的：控制异源蛋白的含量以防超量后引起机体免疫反应测定法：酶联免疫吸附剂测定法ELISA2、外源性DNA残留量的检查目的：防止外源性DNA对人类的危害测定法：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白分析系统、实时定量PCR技术,3、产品相关杂质的检查同系物、异构体、降解产物等测定法：HPLC和CE4、残余抗生素的检查目的：控制生物制品制备时抗生素的用量测定法：抑菌试验,安全性检查,常规热源和细菌内毒素的检查异常毒性试验过敏试验降压物质试验无菌试验一些特殊污染物的检查致突变试验生殖毒
7、性试验,异常毒性试验：是用一定剂量的药物按照指定的操作方法和途径给予规定体重的某试验动物，观察其极性毒性反应。小鼠、LD50,过敏试验：是对生化药物和基因工程药物中的异性蛋白进行进检查。豚鼠、皮肤过敏和腹腔注射,降压物质检查：检查药物中能够导致血压降低的物质，如组胺类。猫或狗,无菌检查：对于不能进行高温灭菌的生物药品，必须进行无菌检查。,一些特殊污染物的检查：主要考虑外源性DNA、一些杂蛋白等。,致突变试验：回复突变试验、染色体畸变试验等,生殖毒性试验,含量测定,HPLCSDS-PAGE,UV or Flueserence,效价测定,第四节：含量（效价）测定,常用的定量分析方法及应用,理化分析
8、法生化分析法生物检定法,理化分析法,化学分析方法电化学分析法光谱分析法色谱分析法,重量法容量分析法,重量法：根据样品中分离出来的单体或化合物的重量测定所含成分的含量的方法。,提取法：用适宜的溶剂提取样品中的某成分后挥去溶剂进行测定的方法。挥发法：利用被测组分的挥发性，或经过衍生化后将其转化成挥发性物质来进行测定的方法。沉淀法：将被测组分转化成沉淀，称定沉淀的重量来计算含量的方法。,比色法,利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan,硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，
9、该产物在525 nm处有最大吸收。,光谱分析方法,具体试验操作：1、制备对照品溶液氨基葡萄糖2、制备供试品溶液硫酸软骨素3、反应和测定缩合反应和比色测定,A平为供试品溶液的吸收度As平为对照品溶液的吸收度Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml）W为称样量（mg）0.8309为校正因子500为稀释倍数,以氨基葡萄糖计24.0,高效液相色谱法,反相高效液相色谱法 RP-HPLCReversed-phase high-performance liquid chromatography高效离子交换色谱法 HPIECHigh-performance Ion-exchange chromatography高效
10、凝胶过滤色谱法 HPGFCHigh-performance Gel-filter chromatography,反相高效液相色谱法,基本原理：利用ODS或C18等极性较小的键合硅胶为填料，以极性较大的methanol-water、CH3CN-H2O为流动相，根据样品在固定相和流动相中的不同保留行为而实现高效分离的一种方法。,可以应用UV、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作为检测器，分离化合物范围广泛。,Determination of AAs by RP-HPLC with pre-column derivation technique,Chromatographic condition
11、sColumn(Beckman Ultrasphere RP-C18(250 4.6 mm,I.D.,5m)Mobile-phase:0.05%TFA(A)and 乙腈-异丙醇（4：1），梯度洗脱。Flow rate:1.2 ml/minColumn temperature:48 Detector:FD 280 nm/430 nm,测定样品的制备：取肽样品置于水解管中加内标加盐酸水解干燥溶解（NaHCO3和EDTA)加反应液（丹酰氯）再加NaOH水解丹酰氯进样分析,生白能的RP-HPLC测定,色谱条件色谱柱：TSK ODS-120T(1504.6 mm,I.D.,5m)流动相:（A）0.1的三
12、氟乙酸,（B）乙腈1三氟乙酸（90：10），梯度洗脱检测波长：214 nm柱温：室温流速：1.0 ml/min,生白能,添加剂,日立835-50型氨基酸自动分析仪；分析柱为2619阳离子交换树脂柱（2.6 mm150 mm）；柱55，缓冲液流速0.225mlmin，茚三酮检测，流速0.3mlmin，进样量50l。分析方法的重复性变异系数2.5，各种氨基酸的回收率平均为95。,核桃仁中氨基酸的HPLC分析测定,取核桃仁粉碎过60目筛，精密称取200 mg，加6mol/L盐酸5ml于玻璃小管中，充氮气后熔封，110水解18h，用4 mol/L NaOH调pH值至中性，用0.02mol/L盐酸稀释至
13、50ml，过0.45m微孔过滤膜，为总氨基酸分析用样品液。,用HPLC法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中18种氨基酸,LC-MS/MS技术分析18种游离氨基酸,高效离子交换色谱法：主要用于蛋白质、多肽和氨基酸等的分离分析，它是根据相应的离子化程度对样品进行分离的，常用盐浓度逐渐增大的方式进行梯度洗脱的。210 mmol/l的离子对试剂,高效凝胶过滤色谱法,根据生物药物的分子量及其极性来对成分进行分离测定，主要用于生化药物的分离和分子量的测定研究。分离产物可以回收、可以用少量表面活性剂来改善分离效果、可根据化合物的形状和分子量大小来预测出峰顺序。具有简便、快速、重现性好、样品用量少等优点。,HP
14、GFC法测定重组仁肿瘤坏死因子（rh-TNF）衍生物的分子量,色谱条件色谱柱：Beckman SEC 3000(3007.5 mm)流动相:0.1mmol/lKH2PO4:0.1mmol/lNa2SO4(1:1)检测波长：280 nm柱温：室温流速：1.0 ml/min,Standards:醛缩酶-2、血清白蛋白-3、碳酸肝酶-4、抑蛋白酶肽-5Inter standard（IS）:右旋糖酐蓝-1、酪氨酸-6,High-performance capillary electrophoresis HPCE,是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实
15、现分离的一种液相分离技术。,电泳 electrophoresis 是指溶液中带电粒子 在电场作用下发生迁移的电动现象。,毛细管电泳 capillary electrophoresis 是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。,特 点,瑞典化学家Tiselius建立了“移界电泳”，成功地将人血清中的蛋白质分为5个主要成分，为蛋白质化学的发展奠定了基础。,毛细管电泳的基本原理,电泳分离的基础,=eE,为离子移动的速度 e为电泳迁移率 E为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。,离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样
16、，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。,电荷-尺寸,电渗流,在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。,基本构造,高压直流电源,分离通道毛细管,检测器,缓冲液贮存瓶,毛细管电泳装置,Meckman,CEC,Agilent,Thermo,一般的进样方式是电动进样和压力进样 电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从
17、缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空，或者通过提高试样端液面。,Detector,UV-vis,ECD,MS,LFD,CL,FlavonoidAlkaloidLigninCoumarinaaProteinPolypeptide,Main separation mode,Capillary Zone Electrophoresis CZE,Micellar Electrokindtic Capillary Chromatography MECC,Capilla
18、ry Isotachphoresis CITP,Capillary Gel Electrophoresis CGE,Capillary electro-chromatography CEC,毛细管区带电泳交束毛细管动电色谱毛细管等速电泳毛细管凝胶电泳毛细管电色谱,Sophora subprostata,Tamsulosin坦索洛新,Individual plasma concentrationtime curves of anisodamine enantiomers after an i.g.administration of 140 mg/kg in five rabbits.(1)(6R
19、,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.,Individual plasma concentrationtime curves of anisodamine enantiomers after an i.v.administration of 50 mg/kg in five rabbits.(1)(6R,2S)-,(2)(6S,2R)-,(3)(6R,2R)-,(4)(6S,2S)-anisodamine.,Editor-in-Chief,Ziad El Rassi(Stillwater,OK,USA,jabout/10008330/2027_edbd.html,IF=4.101,【练习与思考】,1、名词解释：生化药物、生物制品、联合疫苗2、简述生物制品的种类及特点？3、简述生物制品的安全性检查内容及要求？4、简述生物制品含量测定中的高效液相色谱法的分类及特点？,
