《生物制品》PPT课件.ppt

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1、第18章 生物制品,第一节 概述,历史的灾难：传染病/战争,传染病黑热病（腹股沟淋巴结炎性鼠疫）：公园前543548年 在康士坦丁堡，仅仅4个月就夺去20万人的生命。在1346年，近1/3的欧洲人死于这次大流行，20世纪初，黑死病大流行夺走了印度超过100万生命流感：的10个月内，有5000万人死亡，人数多于第 1次世界大战战亡人数（900万军人死亡、2000万人受伤、1000万人饿死病死）。战争一战：动员兵力7340万余人，参战部队2900万人，死于战场的约 1000万人，受伤约2000万人。二战：共有5700万人死亡。,一 免疫学发展简史,分3个阶段：经验免疫学时期（公元10世纪起19世纪

2、）科学免疫学时期（19世纪末20世纪中叶）独立学科形成时期 免疫学诞生（20世纪60年代）现代免疫学（20世纪90年代）,图1-1鼠疫流行的历史记载Fig 1-1 Historical Review of the Plague Epidemic,经验免疫学阶段（16-19世纪）,人痘苗中国人 16-17世纪1796年，英国人Edward Jenner发明牛痘苗预防天花（cowpox vaccine）,中国古代种痘图 Variolation,天花病毒（Pox virus）,人们对疫苗的恐惧,宝贝，接种疫苗啦！,科学免疫学时期（19世纪末-20世纪中叶）,人工主动免疫（Artifical acti

3、ve immunity）1880年，法国的 Louis Pasteur 减毒活疫苗技术（Live-attenuated vaccine）鸡霍乱弧菌减毒疫苗预防炭疽、狂犬病的减毒疫苗。,进入科学王国的最完美无缺的人,人工被动免疫（passive immunity）1888年，Roux和Yersin 白喉的致病机制是由白喉杆菌外毒素所致1890年，德国学者Behring和日本学者北里(Kitasato）用白喉杆菌外毒素免疫马，然后用这种免疫血清，即抗毒素来治疗白喉，首先在人体获得成功,（2）免疫应答机制的研究细胞免疫（cellular immunity）俄国科学家梅契尼柯夫 机体的免疫机制，主要就

4、是以增强了吞噬功能的白细胞所发挥的吞噬作用体液免疫（humoral immunity）Ehrlich等 体液中产生了针对各种病原微生物的相应抗体,并发现在试管中这些抗体能与相应的病原体微生物发生凝集和沉淀等现象1903年，Wright及Douglas把细胞学说与体液学说统一起来 1903年Wright及Douglas仔细观察了Metchnikoff提出的吞噬作用(phagocytosis)，并证明相应的抗体能增强吞噬细胞对相应细菌的吞噬，这种抗体被称为调理素(opsonin)，从此把细胞学说与体液学说统一起来,(3)抗体形成机制侧链假说（side chain postulate）为了说明抗毒素

5、产生的机理，Ehrlich于1908年提出了侧链学说(side chain theory)。这个学说的基本含义是：机体细胞表面具有多种不同的侧链(受体)，细菌毒素可与相应的侧链结合，对细胞起到某种刺激作用，促使与该毒素相结合的侧链过剩产生。过剩产生的侧链(即抗体)释放到体液中，由于它能与毒素结合，而妨碍了毒素与细胞的结合，发挥抗毒素的作用 如以现代免疫应答的概念来说明这一问题，即只有特异性的抗原，才能识别产生特异性抗体的细胞，才能刺激这样的细胞产生抗体。所以说，侧链学说为后来提出的选择学说提供了理论依据。它和现在的知识有许多的一致之处。如，抗体的作用是在细胞外中和毒素，抗体是细胞产生的，抗体本

6、身就是细胞的受体等等，与现在的知识完全吻合。,Burnet克隆选择学说1960，F.M.Burnet,体内存在着无数抗原特异性（TCR、BCR）淋巴细胞克隆。胚胎期与自身成分反应的T、B淋巴细胞被“禁忌”，形成免疫耐受。出生后淋巴细胞遇到相应抗原而被选择发生特异应答，产生抗体或致敏淋巴细胞，并形成记忆（Tm、Bm）。“禁忌”细胞突变，可导致自身免疫。,(3)抗体形成机制,(4)免疫病理概念的形成 免疫病理:指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。过敏反应（anaphylaxis）20世纪初，Richet和 Portier移植排斥（graft rejection）,免疫学科形

7、成与现代免疫学时期（1945年至今）,免疫系统的认识和确立（20世纪50以后)免疫器官：骨髓（腔上囊）/胸腺 淋巴结 免疫细胞：T细胞细胞免疫 B细胞体液免疫 淋巴细胞再循环免疫分子：抗体、补体、细胞因子等,（1）抗原与抗原表位 antigen&Epitope（20纪，Kar Landsteiner)（2)抗体的研究 抗体与丙种球蛋白：1938年，Tiselius等 抗体是由浆细胞产生：1949年，Astrid等 抗体的基本化学结构：20世纪50年代，Porter 和 Edelman 抗体的基因结构：20世纪70年代，利根川进,(3)免疫遗传学研究MHC（主要组织相容性复合体）抗体多样性抗体多

8、样性遗传控制(genetic control of antibody diversity)1978年，Tonegawa:克隆了Ig的V、C区基因，使免疫学进入 分子免疫学（molecular immunology）,(4)免疫学理论体系的形成,克隆选择学说（clonal selection theory）免疫耐受机制研究(research of immune tolerance mechanisms)免疫应答机制研究(research of immune response mechanisms)早期的细胞免疫与体液免疫学说(cellular immunity and humoral immun

9、ity theory at early stage)免疫应答分子机制的阐明（elucidation of molecular mechanisms of immune response）,生物制品（biological products）从微生物（包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等）及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂统称为生物制品。包括各种疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂（如胸腺肽、免疫核酸等）、诊断试剂等。,二、生物制品的基本概念,根据用途又可将生物制品分为预防类、治疗类和

10、诊断类三大类制品。预防类治疗类制品诊断类制品,三、生物制品的分类,1、预防类制品,此类制品主要用于感染性疾病的预防。常用的有如下几种疫苗类毒素 由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成的。常用的有白喉、破伤风、肉毒类毒素及葡萄球菌类毒素等混合制剂 常用的混合制剂的有以下几种。联合细菌 伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗，霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗。联合病毒 麻疹、牛痘苗联合疫苗，麻疹、风疹联合疫苗，风疹、腮腺炎联合疫苗，麻疹、腮腺炎风疹联合疫苗。细菌和类毒素混合制剂 白喉毒素类、百日咳菌苗和破伤风类毒素混合制剂,2.治疗类制品,抗血清与抗毒素 用特定抗原免疫马、牛或羊，经采血、分离血浆或血清，精制而成

11、。抗细菌和病毒的称抗血清；抗蛇毒和其他毒液的称抗毒血清，抗微生物毒素的称抗毒素。血液制品 人血白蛋白，人免疫球蛋白，人凝血因子，红细胞浓缩物等噬菌体 用于裂解宿主菌，以治疗由宿主菌所引起的疾病，如痢疾杆菌噬菌体和绿脓杆菌噬菌体，可分别用于治疗菌痢和绿脓杆菌感染症，但其疗效尚难肯定。,疫苗 乙型肝炎治疗疫苗；单纯疱疹病毒疫苗；麻风病治疗疫苗；其他治疗疫苗。抗体 抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体，单克隆抗体靶向制剂等。细胞因子 干扰素,白介素，集落刺激因子，红细胞生成素重组DNA产品,细胞因子,许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效用，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL

12、-1、IL-2、IFN-7、IL-6等。作用主要表现在以下两个方面：增强机体的抗感染能力，增强疫苗的保护效应，研究表明，在注射抗原的同时或预先注射细胞因子，可明显增强针对该抗原的免疫应答能力。,3.诊断类制品,体内诊断用品 用于皮内接种，以判断个体对病原的易感性或免疫状态。如锡克毒素和结核菌素等。体外诊断用品 生物制品除体外诊断用品外，其他均直接应用于人体，故各国及世界卫生组织对其质量均有严格要求。,四、生物制品的免疫学基础,1、机体的抗感染免疫 机体的抗感染免疫传统上分为先天性免疫和获得性免疫两大类。,2、人工免疫,人为地给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或直接输入免疫血清，使其获得某种特

13、殊抵抗力，用以预防或治疗某些疾病者，称为人工免疫（ariticial immunization）。人工免疫用于预防传染病时，常称预防接种，它是增强人体特异免疫力的重要方法。,（1）人工主动免疫,人工自动免疫（artificial active immunization）是给机体输入抗原物质，使免疫系统因抗原刺激而产生类似感染时所发生的免疫过程，从而产生特异性免疫力。这种免疫力出现较慢，常有1-4周诱导期，但维持较久，可从半年到数年。用于人工自动免疫的抗原性制剂，大部分由病原微生物直接制成，称为疫苗；取微生物毒素去毒而制成，称为类毒素。,（2）人工被动免疫,人工被动免疫(artificial p

14、assive immunization)是人为将抗毒素、正常人免疫球蛋白等现成免疫效应物质输入机体，使机体立即获得特异性免疫力以达到某些疾病防治的目的。维持时间常较短暂（23周），多用于治疗或紧急预防传染病。,3.机体免疫的机制,人类免疫系统主要分为两大类，即体液免疫和细胞免疫体液免疫也就是通过形成抗体而产生的免疫能力；抗体是由血液和体液中的B细胞产生，主要存在于体液中，它可与入侵的外来抗原物质相结合，使其失活。细胞免疫是指主要由各种淋巴细胞来执行的免疫功能。,抗原,抗原肽,细胞表面复合物,活化的B细胞(浆细胞),淋巴因子,活化的T细胞,抗体,杀灭抗原分子,抗原显示细胞(如树状细胞),吞噬、分

15、解,MHC蛋白质(组织匹配性抗原),识别、激活,杀伤性T细胞,分泌,激活释放,激活释放,图10-1 人体免疫系统工作机制示意图,第二节 疫苗,一、疫苗的定义 一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质，多糖，核酸，活载体或感染因子。分为细菌类及其类毒素类疫苗，病毒类疫苗，蛋白疫苗及核酸疫苗。,第一代疫苗,灭活疫苗（也称死疫苗）指的是用物理或化学方法将病原微生物杀死或灭活后制备的生物制品，如霍乱菌苗和百日咳菌苗等。必须多次接种，且注射量较大减毒活疫苗 是用人工筛选或诱导变异的方法制备的使毒

16、力高度减弱或基本无毒的活生物制品，如结核菌苗和痢疾活菌苗等。注射量少，维持时间长，只需接种一次。,第二代疫苗,亚单位疫苗 指的是提取病原微生物体内能刺激机体产生保护性免疫的有效抗原成分制备的疫苗合成肽疫苗 依据有效免疫原性肽段的氨基酸序列设计与合成免疫原性多肽基因工程疫苗 将编码免疫原的基因进行克隆，修饰和改造并借助载体转移至另一生物体基因组中，使之表达并产生所需抗原肽而制成的疫苗 这类疫苗以其成分单一、效果明确、无致病作用为特点、但其工艺复杂、价格昂贵等问题限制了应用的范围。,亚基疫苗（subunitvaccine）,概念：利用病原体的某一部分通过基因工程克隆而制得的疫苗称为亚基疫苗。原理：

17、对于致病性病毒而言，单纯的外壳结合蛋白即可在受体内激发生成足够多的抗体。优点：避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危险亚基疫苗和用纯的蛋白质作为免疫原，可以避免由于外源蛋白、核酸的混杂而造成的种种副作用，使得这种疫苗具有更高的安全性有时因单独使用特异蛋白能增强疫苗的效果,局限性：纯化单一蛋白成本很高纯化后的蛋白的构象与在病原体体内时可能不同，从而导致抗原性发生变化。由于亚基疫苗一般不具有感染性，很难激活杀伤性T细胞，即只能激活机体的体液免疫，因不能同时调动细胞免疫，激活的免疫反应一般较弱。,活体重组疫苗,通过基因工程的方法，对非致病性微生物（细菌和病毒）进行改造，使之携带并表达某种特定病原

18、体的抗原决定簇基因，产生免疫原性；或通过基因工程的方法修饰或删除致病性微生物的毒性基因，使之仍保持免疫原性所制成的疫苗。在这种疫苗中抗原决定簇的构象与致病性病原体的抗原的构象相同或非常相似，克服了亚基疫苗在纯化时，因蛋白质构象的改变而导致的抗原的变化和单一抗原只能诱发较弱的免疫应答的缺点。,第三代疫苗,DNA疫苗（也称基因疫苗或核酸疫苗），是用编码有效免疫原的基因重组体，直接接种，使机体表达保护性抗原，并建立特异性免疫。如流感病毒核蛋白DNA疫苗近年发展起来的用表达特定抗原蛋白的核酸制成的核酸疫苗，因具有高效、持久、广谱、简便、稳定、廉价、无致病性等特点发展得十分迅速、在短短几年时间，就有7种

19、核酸疫苗（HIV、HBV、单纯保证病毒、流感病毒、结核病毒、疟原虫、T细胞淋巴瘤）经FDA批准进入临床试验。,核酸疫苗,核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因的在生物体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,优势,诱导机体产生全面的免疫应答（体液和细胞介导的免疫反应），其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；无潜在致病作用，具有可靠地安全性；能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性稳定性好、易纯化、易保藏、可大规模生产、成本低；可将编码不同抗原的基因构建在同

20、一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；既有预防作用也有治疗作用。,二、病毒类疫苗制造方法不同疫苗的制备工艺各异，但主要程序相似，图为一般疫苗的制备流程。,毒株,毒种,纯化病毒悬液,原苗,原料,感染动物,已感染组织,灭活疫苗,含病毒悬液,动物或胚胎,健康动物(或胚胎),组织,生长细胞,细胞悬液,原苗,活疫苗,配制,培养基,灭活原苗,灭活疫苗,检定,稀释检定,研磨悬浮,解剖,感染,接种,稀释检定,稀释检定,剪碎消化,培养洗涤,培养收获,灭活,检疫,图10-2 病毒类疫苗的一般制备工艺流程,1.毒种的选择和减毒,毒种必须有特异的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，这种免

21、疫力足以阻止有关的病原体的侵入和防止机体发生相应的疾病。毒种应有典型的形态和感染特定组织的特性，并在传代的过程中，能长期保持生物学特性毒种易在特定的组织中大量繁殖,毒种在人工繁殖的过程中，不应产生神经毒素或能引起机体损害的其他毒素。如为制备活疫苗，毒种在人工繁殖的过程中应无恢复原致病力的现象，以免在疫苗的使用时，机体发生相应的疾病毒株在分离时和形成毒种的全过程中应不被其他病毒所污染，并需要保持历史记录,用于制备活疫苗的毒种，往往需要在特定的条件下将毒株经过长达数十次或上百次传代，降低其毒力，直至无临床致病性，才能用于生产。,2.病毒的繁殖,所有动物病毒，只能在活细胞中繁殖。活体动物培养鸡胚培养

22、组织培养细胞培养,活体动物培养（在生产中已逐渐被淘汰）,将病毒接种动物的鼻腔，腹腔，脑腔或皮下，使之在相应的细胞内繁殖。缺点：是动物饲养管理麻烦和具有潜在病毒传播的危险,鸡胚培养,将病毒接种到714日龄鸡胚和尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等处，接种的部分亦因病毒种类的不同各异。成本大，不宜于大规模使用黏病毒（如流感病毒、麻疹病毒等）和痘病毒（如牛痘病毒等）外，其他病毒已很少用鸡胚进行培养。,组织培养（广泛用于病毒培养）,目前，差不多所有人类和动物的组织都能在试管中培养。基本方法如下：无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗。以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成12mm小块，移入培养瓶。加入合适的培

23、养基浸润组织。小心地将培养瓶平翻180，搁置1530min，以利组织块的贴壁生长。翻回培养瓶，平卧静置37培养。,细胞培养,用于疫苗生产的主要有原代细胞培养（将动物组织进行一次培养而不再传代）和传代细胞培养（长期传代的细胞株）两种方法,细胞培养,培养动物细胞的一般步骤：无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净。以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙离子和镁离子低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养。大量培养哺乳动物细胞步骤：（1）微导管培养法（2）微载体培养法（3）微胶囊培养法,细胞培养时主要控制以下内容：,1.常用的维持液和生长液

24、2.培养条件的控制：pH值的控制7.00.2，培养基中的磷酸盐和碳酸氢钠有助于保持pH值的稳定。CO2的提供 CO2分压保持在5%左右氧的提供用通气、摇瓶或转瓶培养的方法培养容器内壁洁净度的控制 合成洗涤剂可以用来取代硫酸铬酸混合液细菌污染的控制 灭菌、抗生素培养温度和时间的控制37、一般为24天，大多为3天,灭活,组织,细胞悬液,消化,病毒稀释液,生长细胞,原苗,健康动物,灭活原苗,稀释鉴定分装,稀释鉴定分装,活疫苗,灭活疫苗,轧盖贴标签,质检,3.疫苗的灭活,不同的疫苗，其灭活的方法不同，有的用甲醛溶液（如乙型脑炎疫苗,脊髓灰质炎灭活疫苗和斑疹伤寒疫苗等），有的则用酚溶液（如狂犬疫苗）所用

25、灭活剂浓度则与疫苗中所含的动物组织量有关。灭活温度和时间，需视病毒的生物学性质和热稳定性质而定。有的可于37度灭活12d（如脊髓灰质炎灭活疫苗），有的仅需1820度下灭活3d（如斑疹伤寒疫苗）,4.疫苗的纯化,疫苗纯化的目的，是去除存在的动物组织，降低疫苗接种后可能引起的不良反应。用细胞培养所获得的疫苗，动物组织量少，一般不需要特殊的纯化。但在细胞培养的过程中，需用换液的方法除去培养基中的牛血清（无血清培养液的使用）,5.冻干,疫苗的稳定性较差，一般在28下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。冻干的要点是：先将疫苗冷冻至共融点以下，在真空状态下降水分直接由固态升华为气态，然后缓慢升温

26、，不使疫苗在任何时间下有融解情况发生，直至完全干燥，冻干的疫苗在真空或充氮后密封保存，使其残余水分保持3%以下。这样的疫苗将能保持良好的稳定性。,三、细菌类疫苗和类毒素类的一般制造方法,一般细菌类疫苗和类毒素制备的工艺流程如图,减毒菌种,病原菌,菌株,培养基,菌种,蛋白胨、肉浸液等原料,培养,毒素,活疫苗,菌苗原液,菌液,分离,吸附精制类毒素,精制类毒素,类毒素,稀释检定,死菌菌苗,死菌原液,稀释检定,杀菌,过滤,配制灭菌,减毒,检定,Al(OH)3吸附检定,纯化,脱毒,图10-3 菌苗和类毒素的一般制备工艺流程,1.菌种的选择,用于菌苗的菌种，一般须具备以下几个条件菌种必须持有特定的抗原性，

27、能使机体诱发特定的免疫力，阻止有关病原体的入侵或防止机体发生相应的疾病。菌种应具有典型的形态，培养特性和生化特性，并在传代的过程中，能长期保持这些特性。菌种应易于在人工培养基上培养。如系制备死菌苗，菌种在培养过程中应产生较小的毒性。如系制备活菌苗，菌种在培养过程中应无恢复原毒性的现象，以免在使用时，机体发生相应的疾病如系制备毒素，则菌种在培养的过程中应能产生大量的典型毒素。,2.培养基的营养要求,除碳源，氮源和各种无机盐类等培养微生物所需要的一般营养要素外，由于某些微生物生理上的特殊性，往往需要某些特殊营养物(如生长因子，某种氨基酸等)才能生长。,3.培养条件的控制,（1）氧分压 各种细菌（需

28、氧菌，厌氧菌和兼性厌氧菌）在生长时对氧量的要求不同。（2）温度 最适培养温度，大都接近人体正常温度（3537）（3）pH值 pH值不同，细菌的代谢可能不同，这是由于抑制或增进了细菌的某些酶的活性引起（4）光 培养不应在阳光或X射线下进行，以防止核糖核酸分子的变异，从而改变细菌的生物学特性（5）渗透压 一般细菌的细胞壁较坚固，能在低渗环境下生存，在高渗透压环境下细菌收缩而死亡。,4.杀菌,只有死菌疫苗制剂在制成原液后需要用物理或化学方法杀菌，而活菌苗不必经过此步骤。各种菌苗所用的杀菌方法不相同，但杀菌的总目标是彻底杀死细菌而又不影响菌苗的防病效力以伤寒菌苗为例，可用加热杀菌法，甲醛溶液杀菌，丙酮

29、杀菌等方法杀死伤寒杆菌,5 稀释，分装和冻干,经杀菌的菌液，一般用含防腐剂的缓冲生理盐水稀释至所需的浓度,然后在无菌条件下分装于适当的容器。封口后在210保存，直至使用。有些菌苗，特别是活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥，以延长它们的有效期。,5.稀释，分装和冻干,经杀菌的菌液,含防腐剂的缓冲生理盐水稀释,浓度,无菌条件下,分装 封口,活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥,（210保存）,第三节 生物制品质量要求与检定,一、生物制品的质量要求 生物制品必须具备两个重要条件，即安全和有效。（WHO）要求各国生产的制品必须有专门检定机构负责成品的质量检定，并规定检定部门要有熟练的高级技术人员，精良的设备条件，以

30、保证检定工作的质量。未经指定检定部门正式发给检定合格证的制品，不准出厂使用。,生物制品的质量检定包括安全性和效力检定两方面。安全性包括毒性试验，防腐剂试验，热原质试验，安全试验，有关安全性的特殊试验等5项；效力检定包括浓度测定（含菌数或纯化抗原量），活菌率或病毒滴度测定，动物保护率试验，免疫抗体滴度测定，稳定性试验等5项,二、生物制品的质量检定,（一）理化性质检定（二）安全试验（三）效力试验,（一）理化性质检定物理性状的检查（1）外观（2）真空度及溶解速度（3）装量蛋白质含量测定纯度检查及鉴定试验相对分子质量或分子大小测定防腐剂含量测定,1.物理性状的检查（1）外观 通过特定的人工光源进行目测

31、，对外观类型不同的制品，有不同的要求标准。（2）真空度及溶解速度 真空封口的冻干制品，应通过高频火花真空测定器测定真空度，瓶内应出现蓝紫色辉光。另外，取一定量冻干制品，按规程要求，加适量溶剂，其溶解速度应在规定时限以下。（3）装量 各种装量规格的制品，应通过容量法测试，其实际装量不得少于标示量（粘瓶量除外）,2.蛋白质含量测定,目的：检查其有效成分或蛋白杂志是否符合规程要求。根据蛋白质含量，还可以计算出抗毒素的纯度（U/g蛋白）方法：凯氏定氮法，双缩脲法，酚试剂法（Lowry法），紫外吸收法,3.纯度检查及鉴别试验,血液制品，抗毒素和类毒素等制品，需要进行纯度检查或做鉴别试验.方法；区带电泳，

32、免疫电泳，凝胶层析，超速离心等技术进行分析,4.相对分子质量或分子大小测定,对提纯的蛋白质制品如白蛋白，丙种球蛋白或抗毒素，在必要时需测定其单体，聚合体或裂解片段的相对分子质量及分子的大小；提纯的多糖体疫苗需测定多糖体的分子大小及相对含量。方法：凝胶层析法；SDS-PAGE法；超速离心分析法,5.防腐剂含量测定,生物制品在制造过程中，为了脱毒，灭活或防止杂菌污染，常加入苯酚，甲醛，氯仿，硫柳汞等试剂作为防腐剂或灭活剂。防腐剂的含量过高能引起制品有效成分的破坏，注射时也易引起疼痛等不良反应。各种防腐剂的含量都要求按生物制品质量检定规程控制在一定的限度以下,（二）安全试验,一、毒种或主要原材料的检

33、查 用于菌疫苗生产的菌毒种，除按有关规定严格管理外，投产前必须按中国药典的规定，进行毒力，特异性，培养特性等安全性试验；保证投产的血液制品不含病源物质二、半成品（包括原液）的检查 检查对活菌，活毒或毒素的处理，如杀菌，灭活和脱毒是否完善，是否有污染，灭活剂和防腐剂是否过量等,三、成品检查 制品在分装或冻干后，必须进行出厂前的最后安全检查。按制品的各项不同要求，进行无菌试验，纯菌试验，毒性试验，过敏性试验，热原质试验及安全试验（指某制品的单项试验）等,安全试验包括以下四个方面的内容,1.外源性污染的检查除无菌与纯菌试验外，还需进行以下项目的检查。（1）野毒检查 可能通过培养病毒的细胞（如鸡胚细胞

34、，地鼠肾细胞和猴肾细胞等）带入有害的潜在病毒，这种外来病毒亦可在培养过程中繁殖，使制品污染，故应进行野毒检查。,（2）热原质试验血液制品，抗毒素，多糖菌苗等制品，其原材料或在制造过程中，有可能被细菌或其他物质污染并带入制品，引起机体的致热反应。以家兔试验法作为检查热原的基准方法，对产品进行热原质检查。,家兔法,为各国药典收载的方法，属于体内检查法。该法检查热原的原理是基于家兔对热原的反应与人是相同的。系将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，然后在规定时间内测定家兔体温升高情况以判断供试品所含热原限度是否符合规定。具体方法及结果判断标准参看中国药典2000年版二部附录。,鲎（hu）试验法,鉴于家兔

35、法费时较长，操作繁琐，近年来发展了体外热原试验法即鲎试验法，其原理是利用鲎试剂与细菌内毒素产生的胶凝反应来判断细菌内毒素的限量是否符合规定。鲎试剂来源于鲎（limus polyphemus）血液的变形细胞溶解物(amebecyte lysate)，其含有凝固酶原、凝固蛋白原及钙离子。胶凝反应如下：,（3）乙型肝炎表面抗原（HBsAg）检查 血液制品除了对原材料（献血员血液，胎盘血液）要严格进行HBsAg检查外，对成品亦应进行该项检查,2 杀菌，灭活和脱毒检查,方法：常用甲醛溶液或苯酚作为杀菌剂或灭活剂（1）无菌试验基本与检查外源性杂菌方法相同。目的主要是检查有无生产菌（毒）种生长，先用液体培养

36、基进行稀释和增殖再进行移种致适于本菌生长的培养基。,（2）活毒检查主要是检查灭活疫苗。须用对原毒株敏感的动物进行试验，一般多用小白鼠。（病毒，细菌（3）解毒试验主要用于检查类毒素等需要脱毒的制品。须用敏感的动物检查。,3.残余毒力和毒性物质的检查,（1）残余毒力检查 所谓残余毒力是指生产这类制品的毒种本身是活的减毒（弱毒）株，允许有一定的轻微毒力存在，并能在接种动物机体后反映出来。此项测定目的是控制活疫苗的残余毒力在规定范围。（2）无毒性检查（一般安全试验）一般制品在没有明确规定的动物安全试验项目时，或不明了某制品是否会有何种不安全因素时，常采用较大剂量给小鼠或豚鼠作皮下或腹腔注射，观察动物有

37、无不良反应。,（3）毒性检查 死菌苗,组织培养疫苗或白蛋白等制品，经杀菌，灭活，提纯等制造工艺后，其本身所含的某种成分可能仍具有毒性，当注射一定量时，可引起机体的有害反应，严重的可使动物死亡。故对此类制品的毒性反应必须试验。（4）防腐剂检查 除活菌苗，活疫苗及输注用血液制品外，其他凡加有一定量防腐剂的制品，除用化学方法作定量测定外，还应作动物试验。含有苯酚防腐剂者，采用小白鼠试验，观察注射后的颤栗程度及局部反应。以便控制产品中防腐剂的含量。,4.过敏性物质的检查,（1）过敏性试验（变态反应试验）采用异体蛋白为原料制成的治疗制剂如治疗血清，代人血浆等，需检查其中过敏原的去除是否达到允许限度。一般

38、用豚鼠进行试验。（2）牛血含量的测定主要用于检查组织培养疫苗（如乙型脑炎疫苗，麻疹疫苗，狂犬病疫苗），要求其含量不超过1ug/ml。由于牛血清是一种异体蛋白，如制品中残留量偏高，多次使用能引起机体变态反应，故应进行监测。测定方法一般采用间接血球凝集抑制试验或反向血球凝集试验,（3）血型物质的检测用人胎盘血或静脉血制备的白蛋白和丙种球蛋白，常有少量的A或B血型物质，可使受试者产生高滴度的抗A，抗B抗体，O型血孕妇使用后，可能引起新生儿溶血症。因此，对这类制品应检测血型物质，并应规定其限量。（抗抗体：）,（三）效力试验,1.免疫力试验（1）定量免疫定量攻击法（2）变量免疫定量攻击法（3）定量免疫变

39、量攻击法2.活菌数和活病毒滴度测定（1）活菌数（率）测定（2）活病毒滴度测定3.类毒素和抗毒素的单位测定（1）絮状单位（L1）测定（2）结合单位（BU）测（3）抗毒素单位测定,4.血清学试验5.其他有关效力的检定和评价（1）鉴别试验（2）稳定性试验（3）人体效果观察人体皮肤反应观察血清学效果观察流行病学效果观察,（三）效力试验,生物制品的效力：1、指制品中有效成分的含量水平2、指制品在机体中建立自动免疫或被动免疫后所引起的抗感染作用的能力诊断用品，其效力则表现在诊断试验的特异性和敏感性。,效力试验包括以下五个方面的内容：,1、免疫力试验将制品对动物进行自动（或被动）免疫后，用活菌、活毒或毒素攻

40、击，从而判定制品的保护力强弱。（1）定量免疫定量攻击法用豚鼠或小鼠，先以定量制品（抗原）免疫2-5周后，再以相应的定量最小致死量（MLD）或最小感染量（MID）毒种或毒素攻击，观察动物的存活数或不受感染的情况，以判定制品的效力,（2）变量免疫定量攻击法 即50%有效免疫剂量（effective dose ED50，infectious dose ID50）测定法。疫苗经系列稀释，制成不同的免疫剂量，分别免疫各组动物，间隔一定日期后，各免疫组均用同一剂量的毒种攻击，观察一定时间，用统计学方法计算出能使50%的动物获得保护的免疫剂量。此法多用小白鼠进行，其优点是较为敏感和简便。,（3）定量免疫变量

41、攻击法即保护指数（免疫指数）测定法。动物经制品免疫后，其耐受毒种的攻击量相当于未免疫动物耐受量的倍数，称为保护指数。此法常用于死疫苗及灭活疫苗的效力检定。,（4）被动保护力测定先用其他免疫机体（如人体）获得某制品的相应抗血清，用以注射动物，待一至数日后，用相应的毒种攻击，观察血清抗体的被动免疫所引起的保护作用,2、活菌数和活病毒滴度测定（1）活菌数（率）测定卡介苗、鼠疫活菌苗、布氏菌病活菌苗、炭疽活菌苗等多以制品中抗原菌的活存数（率）表示其效力。比浊法 稀释 平板计数，,10倍或2倍系列稀释,测定含菌浓度,计算活菌率,（2）活病毒滴度测定活疫苗（如麻疹疫苗、流感活疫苗）多以病毒滴度表示其效力。

42、病毒滴度 也即病毒的毒力，或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD50)，其中以LD50最常用。常用组织培养法或鸡胚感染法测定,3、类毒素和抗毒素的单位测定,（1）絮状单位（L1）测定能和一个单位抗毒素发生絮状沉淀反应的（类）毒素量，即为一个絮状单位。此单位数常用以表示类毒素或毒素的效价。（2）结合单位（BU）测定能与0.01单位抗毒素中和的最小类毒素量称为一个结合单位。常用以表示破伤风类毒素的效价。用中和法通过小鼠测定。,（3）抗毒素单位测定目前国际上都用“国际单位”（IU）代表抗毒素的效价概念：当与一个致死限量的毒素作用后，再注射动物（小白鼠

43、、豚鼠或家兔），仍能使该动物在一定时间内（96h左右）死亡或呈现一定反应所需要的最小抗毒素量，即为一个抗毒素国际单位。常用中和法测定。,4、血清学试验主要用来测定抗体水平或抗原活性。预防制品接种机体后，可产生相应抗体，并可保持较长时间。常用以血清学方法检查抗体或抗原活性，并多在体外进行试验。包括沉淀试验、凝集试验、间接血凝试验、间接血凝抑制试验、反向血凝试验、补体结合试验及中和试验等。,5、其他有关效力的检定和评价,（1）鉴别试验 亦称同质性（identity）试验。一般采用已知特异血清（国家检定机构发给的标准血清或参考血清）和适宜方法对制品进行特异性鉴别。（2）稳定性试验制品的质量水平，不仅

44、表现在出厂时效力检定结果，而且还表现于效力稳定性。因而需对产品进行稳定性测定和考察。一般方法是将制品放置不同温度（210,25,37），观察不同时间（1周，2周，3周.;1月，2月，3月.）的效力下降情况。,（3）人体效果观察有些用于人体的制品，特别是新制品，仅有实验室检定结果是不够的，必须进行人体效果观察，以考核和证实制品的实际质量。观察方法常有以下几种。人体皮肤反应观察 一般在接种制品的一定时间后（1月以上），再于皮内注射反应原，观察24-48h的局部反应，以出现红肿、浸润或硬结反应为阳性，表示接种成功。阳转率的高低反映制品的免疫效果，也是细胞免疫功能的表现。,血清学效果观察 将制品接种人

45、体后，定期采血检测抗体水平，并可连续观察抗体的动态变化，以评价制品的免疫效果和持久性。它反映接种后的体液免疫状况。流行病学效果观察 在传染病流行期的疫区现场，考核制品接种后的流行病学效果；,三、生物制品检定标准品,由于试验动物的个体差异，所用试剂或原材料的纯度或敏感性不一致等原因，往往导致同一批制品的检定结果也往往相互悬殊。用一已知效力的制品作为对照，由对照结果来校正检定试验结果。这种用作对照的制品，就是生物标准，也就是通常所说的标准品或参考品,生物制品的标准品或参考品，必须由世界卫生组织或国家检定机构审定分发。如果是由世界卫生组织审定发出的，就称为国际标准；如果是国家检定机构批准发出的，则称

46、为国家标准。,1.生物制品标准品的要求：（1）要求准确（2）要求冻干（3）要求熔封（4）要有瓶签、说明书和实验数据,2.标准品的分级（1）国际生物标准（2）国际参考制品（3）国际生物参考试剂,一、卡介苗疫苗 病原菌是结合分歧杆菌。卡介苗是Nocard 1902年从牛体分离的一株牛型结核杆菌。如果向培养这株结合杆菌的甘油土豆培养基中加入牛胆汁，则菌种逐步缓慢丧失其毒力。Calmette和Guerin二人从1906年开始采用这个方法，约每23星期传代一次，前后共传了231代，经约13年时间，获得一株稳定的减毒株。,第三节 重要的疫苗制备工艺,牛型结核杆菌减毒株,改良的苏通培养基,3739,1012

47、天,收集幼龄培养物菌膜,盛有不锈钢珠瓶内,适量稀释液,低温下研磨,原液,稀释分装,菌苗,卡介苗表面培养流程图,苏通培养基,在100ml蒸馏水中加入：天门冬素-0.4g枸橼酸盐-0.2g磷酸氢二钾-0.05gMgSO4.7H2O-0.05g枸橼酸铁铵-0.05g甘油-6ml 补加蒸馏水到100ml用氨水调节pH 7.2-7.4,二、白喉疫苗 1923年Romon向白喉毒素内加入0.3%0.4%甲醛，放置38,4周后，其毒性消失，但能使动物产生免疫力，从而制得白喉毒素的类毒素。,干燥菌种,全培养液,产毒培养液,沉淀,精制毒素,滤液,精制类毒素,吸附精制类毒素,种子,传代,保浦氏培养基或其他适宜培养

48、基34-35，48-54h,培养,0.15%甲醛(NH4)2SO4二段沉淀法分离,精制,保浦氏培养基或其他适宜培养基34-35，50h左右,脱毒,0.2%甲醛，室温2-3d0.3%甲醛，36-37，35d,AlPO4或Al(OH3),吸附,溶解，透析，除菌过滤,图10-4 吸附精制白喉类毒素的工艺流程,（1）菌种 采用产高效价毒素的菌株（Pw8）培养基：改良马丁培养基：主要成分为猪胃消化液及牛肉水，将猪胃消化液继续用胰酶消化，提高其氨基氮含量，菌种产毒能力得到很大提高保浦市培养基：胰酶消化牛肉后煮沸过滤形成的消化液，再加入酵母浸液、乳酸、氯化钙等成分构成。改良林氏培养基：由Linggood原制

49、培养基改良而成。,（2）培养产毒a.产毒培养基用保浦氏培养基。在培养过程中必需加入细菌必需的氨基酸、糖类、各种生长因子及无机离子。b.培养 采用深层培养法，以利于细菌生长过程中能源的补充、供氧量的调节及pH的控制，更好发挥细菌产毒的能力。温度控制在3435，pH值为7.68.0，用麦芽糖替代葡萄糖为主要碳源，适当补充氨基酸以满足培养过程中氮水平的稳定。,（3）脱毒 毒素经甲醛加温处理以后，去除毒性而保留其抗原性，形成类毒素。a。脱毒应考虑温度、pH、甲醛浓度以及毒素自身等影响：一般来说温度高、pH高、甲醛浓度高都利于毒素脱毒，但同时却易造成抗原的损失，破坏其免疫原性。毒素浓度过高也不利于毒素脱

50、毒，要适当的稀释。温度一般控制在3739，pH值控制在7.07.5较为适宜。,b.类毒素生产有脱毒后精制和精制后脱毒两种方式。原制毒素脱毒 培养物滤液加0.5%0.6%甲醛，调pH7.57.6,于3739脱毒30d。此法质量稳定，毒性逆转现象极少，但由于含大量培养基残留物质，进一步提高纯度有困难，且脱毒体积大，不利于操作。精制毒素脱毒 将精制毒素进行适当稀释后，再脱毒。方法同上。但是为了防止毒性逆转的发生，要加深脱毒20d。工艺紧凑利于操作，且可获得高纯度制品。但是易发生毒性逆转现象，而长时间的脱毒易造成抗原易损伤。,（4）白喉类毒素的精制去除细菌代谢的产物（菌体蛋白、小分子有机物等）及培养基