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1、1,第3讲：生物质谱 Bio-mass spectrometry，Bio-MS,重庆医科大学药学院 母昭德,硕士生学位课程：蛋白质组学,2,本讲介绍以下内容：,、质谱分析法，质谱仪，质谱图、生物质谱、基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱、电喷雾电离质谱,3,、质谱分析法，质谱仪，质谱图,4,质谱分析法（mass spectrometry，MS）,是将化合物形成离子和碎片离子，按质荷比（m/z）的不同进行分离，来进行成分和结构分析的方法。质谱分析中，多种离子化技术均可使物质分子失去外层价电子形成分子离子（molecular ion，M+），分子离子中的化学键还可以继续发生某些有规律的断裂而形成不同
2、质量的碎片离子（fragment ion）：,M M+碎片离子+中性分子,5,质谱仪的构成,质量分析器,检测器,计算机控制与数据处理,样品导入系统,离子源,真空泵,I,m/z,质谱图Mass spectrum,InletSystem,Ion sources,Mass analyzers,Detector,Datasystem,VacuumPumping system,Simple vacuum lock HPLC,Electrospray(ESI)MALDI,Quadrupole Ion trap Time of flight FTMS,6,质谱图,质谱分析中，按各离子m/z的顺序及相对强度大
3、小记录分析结果的图谱即为质谱图。由于图谱中离子的质量及相对强度是各物质所特有的，即反映了物质的性质和结构特点，因此通过质谱解析可以进行物质的成分和结构分析。常见的质谱图是经过计算机处理后得到的棒图（bar graph）。,7,Typical Mass Spectrum,aspirin,Relative Intensity(%),m/z,8,1450,1455,1460,1465,1470,1475,1480,1485,1490,1495,1500,1505,50,100,1478.72,1462.73,1463.74,1464.74,1465.75,1479.73,1494.72,1480.7
4、4,1481.75,1495.74,1496.72,Relative abundance(%),m/z,MMSHLNHPNIIR,1462.74,MMoSHLNHPNIIR,1478.74,MoMoSHLNHPNIIR,1494.73,高分辨质谱图,9,质谱法的特点,1、不受被分析试样形态限制2、灵敏度高，试样用量少，检测限可达到10-11克。3、分析速度快，完成一次仅需1到几秒，最快可达10-3秒。4、信息直观，质谱图上的质荷比与离子的质量直接相关，质谱图的解释方便易行。5、易于实现与色谱联用。6、应用范围广泛，适用于无机有机物质。,10,、生物质谱(Bio-mass spectrometr
5、y,Bio-MS),是主要用于生物大分子分析的质谱技术。生物质谱要求测定上万甚至是几十万的相对分子质量。随着电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI)和基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted Laser Desorption/ionization，MALDI)技术的完善和成熟，生物大分子的质谱分析才得以实现。,11,The Nobel Prize in Chemistry 2002,for their development of soft desorption ionization methods for mass spectrometric anal
6、yses of biological macromolecules,约翰芬,田中耕一,12,Soft ionization(软电离),质谱分析中采用较低的能量使试样分子电离的技术。采用软电离技术容易获得能指明相对分子质量的准分子离子(M+H)+、(M-H)+，适合于混合物及生物大分子的测定。在蛋白质组质谱分析中使用的软电离技术主要是田中耕一所创立的基质辅助激光解吸电离(MALDI)和约翰芬所创立的电喷雾电离(ESI)。软电离技术的发展不但使质谱技术发生了突破性的革新，而且使质谱技术在生命科学中的应用得到了前所未有的扩展。,13,生物质谱法可以得到三类质谱图,测定生物大分子准确相对分子质量的质谱
7、图以MALDI-TOF获得的准确相对分子质量的质谱图以ESI-MS获得的准确相对分子质量的质谱图,肽质量指纹图（peptide mass fingerprinting,PMF）。以PMF的数据再通过互联网进行数据库搜索。串联质谱（Tandem MS）图（MS/MS质谱图或MSn质谱图）。以Tandem MS的数据再通过互联网进行数据库搜索。,MALDI/TOF Mass Spectrum of IgG,Relative Abundance,m/z,50000,100000,150000,200000,MH+,(M+2H)2+,(M+3H)3+,图中，除分子离子峰M+H+外，还可检测到M+2H2
8、+峰和M+3H3+峰。基质信号出现在低质量范围（5001000Da），它们有准分子离子和一些特别碎片峰，还有光化学反应产生的加合离子。不同基质在低质量区出现分子离子信号的强度不同，条件好时甚至不出现基质峰。,以MALDI-TOF获得的准确相对分子质量的质谱图,15,16951.5,ESI-ion trap spectra of apomyoglobin(脱辅基肌红蛋白),Sample:1 pmole apomyoglobin(horse skeletal muscle)INSTRUMENT:Thermoquest LCQ-classic,以ESI-MS获得的准确相对分子质量的质谱图,经过反卷积
9、处理后的质谱图After deconvolution,实验所得到的质谱图actual spectrum,Relative Abundance,mass,Relative Abundance,1738.35,1570.45,1439.65,2047.21,1894.26,927.77,843.87,2470.78,2210.10,1923.27,1724.38,1000.70,1209.84,1391.67,2807.67,1574.12,2661.87,2066.13,牛血清蛋白(BSP)酶解产物的肽质量指纹图,17,Tandem MS of BSA,18,生物质谱技术进行蛋白质鉴定分析的流程
10、,19,重点介绍两种生物质谱分析方法,基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱,电喷雾电离质谱,20,、基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time of Flight Mass Spectra，MALDI-TOF MS,离子源：基质辅助激光解吸电离质量分析器：飞行时间管,21,基质辅助激光解吸离子化(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization，MALDI),基质辅助激光解吸离子化/飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是近年来获得快速发展的一种软电离生物质谱。MALD
11、I技术是1988年由Tanaka和Hillenkamp F两组科学家所建立，从而突破了生物大分子质谱分析的难题。MALDI是利用一定波长的激光脉冲，在极短的时间间隔，对含被测样品靶物的一个微小区域提供高能量，从固相直接获得离子的电离方法。MALDI特别适用于对热敏感化合物或不挥发化合物的离子化，因此，在蛋白质组分析中得到了广泛的应用。MALDI-TOF MS无论是在理论上还是在设计上都具有简单、高效、灵敏、快速、准确、测定质量范围大等特点。,22,Voyager Biospectrometry Instrumentation,Voyager-DE PRO MALDI-TOFLinear or
12、reflector mode operationPositive or negative ion detectionCompact bench top design,脉冲激光器,2.将样品板放入质谱仪的样品室,4.离子被电场加速，进入真空漂移管,Flight tube,1.样品与基质混合并置于样品板上干燥,高压,3.样品点被激光脉冲照射，解吸，离子化,20-30 kV,5.离子的m/z不同，飞行时间不同，先后到达检测器,计算机工作站对质谱仪的工作条件进行设定，对分析过程进行控制，对分析数据进行分析、贮存和再现,MALDI-TOF MS的工作流程图,高真空,24,激光器置于质谱仪离子源之外，通过
13、一个透光镜聚焦于样品的特定表面。常用的激光器是氮分子激光器（N2 laser），发射波长337nm。用于MALDI的激光器均是短脉冲的（纳秒级），以避免样品受长时间的照射而发生分解。,25,MALDI的基本特点是使用了固体基质（matrix）。基质是指与样品共存，能吸收入射激光，防止激光直接照射供试品使之破坏的物质。样品液与基质液混合，滴于靶面，制成极细的混晶。当激光束打在涂有样品和基质混晶的靶面上时，可使生物大分子发生软电离。基质将能量传递给样品的机制很复杂，一般认为有激光辐照样品引发能量转移、相变化和气态离子的形成等三个过程。,26,hn,Sample(M)is mixed with ex
14、cess matrix(X)and dried on a MALDI plate.The plate is loaded onto the sample stage in the Ion Source,Ground Grid,Sample plate,to Mass Analyzer,Sample&Matrix,MALDI:Matrix Assisted Laser Desorption Ionization,27,MALDI:Matrix Assisted Laser Desorption Ionization,hn,Laser,2.Laser flash on sample neutral
15、s(M).3.Sample molecules are ionized by proton transfer from matrix ions:XH+M X+MH+.X-H-+M X+M-H-,28,hn,Ion Extraction:High voltage is applied to the sample plate,accelerating ions out of the Ion Source into the Flight Tube.,MH+,+20 kV,MALDI:Matrix Assisted Laser Desorption Ionization,29,制备样品时的注意事项,（
16、1）基质的选择,30,基质必须满足一些共性要求：,基质必须在一些常用蛋白质溶剂（如酸化水，水-乙氰混合物，水-乙醇混合物，70%甲酸）中溶解性好。在实际操作中，应将基质配制成饱和溶液（如以60%乙腈0.1%TFA为溶剂，配制成浓度约为20 mg/ml的溶液），离心后使用。对激光具有良好的吸收性能。对于N2激光光源，基质必须有紫外吸收，并有可失去的H（如没有可失去的H，可加入少量酸）。合适的反应活性。对蛋白质或其它分析物起共价修饰作用的基质不能采用，氧化剂由于会破坏二硫键，使半胱氨酸甲硫氨酸基团氧化，应避免作用。醛类化合物也不合适，它们会修饰氨基酸N-端。,31,（2）杂质对基质的影响,MALD
17、I与其它质谱电离源相比，对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂和其他非挥发性成分，但样品中存在的离子型去垢剂、低挥发性溶剂以及某些小分子物质会影响分析结果。,32,（3）样品与基质的混合比例,（4）基质与供试品是否形成共结晶对获得好的分析结果有很大的影响（5）样品板的表面性质也会影响分析结果,33,有紫外吸收的常用MALDI基质,34,Selection of Matrix,35,飞行时间分析器（Time of Flight，TOF）,TOF分析器的离子分离是用非磁方式达到的，离子在离子源中形成后为电场所加速,进入真空无场漂移区，具有不同质荷比的离子因其通过漂移区的时间不同而实现分离，先后到达检测
18、器产生信号。按照仪器的构造不同，又可分为线性飞行时间质量分析器和反射飞行时间分析器。,36,TOF-MS的原理,离子先经过一个加速电场获得动能,再进入一个高真空无电场飞行管道.在此无电场飞行管道内,离子以在加速电场获得的速度飞行.质量较轻的离子飞行速度快,较早到达检测器;较重的离子飞行速度慢,较晚到达检测器.离子的飞行时间与其质荷比的平方根(m/z)1/2 成正比,通过检测飞行时间来测定离子的质荷比.,37,TOF-MS的原理,由 E=U z=mv 2 t=L/v推出 t=const(m/z)其中 E=离子在加速电场获得的动能 U=加速电场电压 z=离子所带电荷 m=离子质量 v=离子飞行速度
19、 L=飞行管道长度 t=离子飞行时间 const 为一常数,38,Time-of-Flight(TOF),E=m112=m222 1 2(m1m2)(m：molecular weight：velocity)Since each ion can receive same energy from laser,small molecular ion can move faster than big molecular ion.,39,MALDI-TOF MS 的应用,40,MALDI-TOF MS测定相对分子质量,MALDI-TOF MS测定相对分子质量使用线性模式或反射模式。对于蛋白质或肽，MAL
20、DI方式主要通过获取或失去一个质子而产生单电荷离子，因此，所形成的正离子和负离子分别是M+H+和M-H-离子，正离子和负离子的产生取决于样品的性质。正离子常常是我们感兴趣的离子。离子一经形成，通过离子提取过程进入TOF质量分析器直接测定准确的相对分子质量。,41,MALDI-TOF MS测定相对分子质量的质谱图例,Example MALDI-TOF linear mass spectrum of intact protein:Hg-Papain Oligomerization.,图中有四种离子:Cytochrome C+Cytochrome C2+Ubiquitin+eq.Myoglobin+
21、,42,MALDI-TOF MS测定肽质量指纹谱,peptide mass fingerprinting,PMF,43,肽质量指纹谱(PMF),PMF是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱，由于其具有特征性,所以称为指纹谱。PMF可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。如果在数据库中找不到，有可能是发现了新蛋白质，要进行序列分析，合成DNA探针来表达分离和鉴定这一蛋白质。,44,为什么要做PMF？,避免MS仪器带来的误差。蛋白质的质量越大，绝对误差值越大。这些误差引入很高的不确定性，使得鉴定不够准确。不是所有
22、的蛋白质都能进行完整蛋白质的质量测定。如MS对大分子蛋白质和疏水蛋白质就很难进行质量测定。完整蛋白质质量测定的灵敏度远低于肽质量测定和肽串联MS分析的灵敏度。,45,酶解可以达到什么目的？,产生最适于MS分析的片段。含有620个氨基酸残基的肽片段对MS分析和数据库比较最为理想。短于6个氨基酸残基的肽片段太短，不能在数据库检索中产生唯一的序列匹配。长于20个氨基酸残基的肽片段难以在串联MS分析中获得序列信息。,46,目前的数据库检索算法是建立在蛋白水解酶在特定位点将蛋白质切割成肽的基础上的，因此，PMF所得到的结果可以直接与蛋白质和核酸序列数据中的蛋白质序列进行比较，鉴定蛋白质的身份。因此，可以
23、认为，用PMF图鉴定蛋白质是目前蛋白质组学研究中的核心技术之一。,47,Peptide Mass Mapping by MALDI-TOF,48,用于制备PMF的酶,易得，纯度高，稳定性好。为提高PMF检索数据库的准确性，产生肽谱的酶切点至少要有两个。胰蛋白酶和Glu-C（V8蛋白酶）较多用于肽谱制备。胰蛋白酶水解位点在赖氨酸(K)和精氨酸(R)的羧基端；Glu-C蛋白酶在pH4.0条件下水解天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的羧基端。,Sample preparation procedures,Destain spots(Cut from 2D-gel),Incubate(37oC),Extrac
24、tDesaltConcentrate peptides,Protein,PeptidesMixture,质谱仪可检定蛋白质身分：,MALDI-TOF，得到PMF,Protease digestion,比对各片段分子量可确定该蛋白质身分,m/z,Unknown protein from 2-DE,Juang RH(2004)Proteomics,51,肽质量指纹图数据的检索,1503.6049701504.6035151505.6060801506.6353441548.6147291549.6358831550.628364,Import mass list into protein data
25、base search program,Set search parameters,Submit search and look for peptides matches in database,Mass list from spectrum,52,、电喷雾电离质谱Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI MS,离子源：ESI质量分析器：四极滤质器或离子阱质量分析器或离子回旋共振分析器,53,54,电喷雾离子化质谱,1984年，美国耶鲁大学化学工程系教授John Fenn为首的研究组首次发表了电喷雾离子化（Electrospray ioniza
26、tion，ESI）的实验结果，并于四年后报道了他们运用ESI MS成功进行蛋白质分析的结果。目前，ESI已成为应用最广泛的技术，ESI与四极质量分析器、离子阱质量分析器、离子回旋共振分析器结合形成的各种类型的质谱分析系统在蛋白质组分析中得到越来越多的应用。ESI MS既可分析大分子，也可分析小分子，对于分子量在1000Da以下的小分子，会产生M+H+或M-H-离子；而生物大分子在ESI MS中生成一系列多电荷离子，通过数据处理也可得到其分子量，准确度优于0.01%。,55,电喷雾离子化（ESI）原理,内衬弹性石英管的不锈钢毛细管（内径0.10.15mm）被加以25kV的正电压，与相距约12cm
27、接地的反电极形成强静电场。被分析的样品溶液从毛细管流出时，在电场作用下形成高度荷电的雾状小液滴；在向质量分析器移动的过程中，液滴因溶剂的挥发逐渐缩小，其表面上的电荷不断增大。当电荷之间的排斥异力足以克服表面张力时（瑞利极限），液滴发生裂分；经过这样反复的溶剂挥发-液滴裂分过程，最后产生单个的气态离子。由于没有外界能量直接作用于分子，因此对分子结构破坏较少，是一种典型的“软电离”方式。,56,ESI包括三个基本的步骤,在喷雾毛细管尖端产生带电雾滴；溶剂蒸发和雾滴分裂；由很小的带电雾滴产生气相离子。,电喷雾针+2+4kV,反电极；将离子导入质量分析器的毛细管,大气压区,电喷雾针+2+4kV,反电极
28、；将离子导入质量分析器的毛细管,真空区（约1mtorr）,液滴,溶剂从液滴 表面蒸发,单个 离子,多肽的0.1%TFA/CAN溶液的电喷雾实际情况。毛细管喷雾针的内径15m，流速200 nl/min，电压2000V。,ESI与MALDI的比较,60,质量分析器(mass analyzer),在生物质谱中，与ESI离子化源配合使用的质量分析器主要有：、四极滤质器、离子阱分析器和离子回旋共振分析器等。随着技术的发展，也可以采用这些分析器的变型或组合。,61,ESI-MS测定相对分子质量,ESI与MALDI不同，后者是蛋白质或肽在固相状态下与基质混合后进行质谱分析，前者则是将蛋白质或肽溶解形成水溶液
29、后进行质谱分析。水溶液中的蛋白质或肽因氨基酸残基上的可电离基团的电离而以离子的形式存在。在ESI-MS分析中，由于带正电荷的蛋白质或肽容易形成，所以，质谱分析大都以正离子模式进行。,62,在ESI条件下，能与多肽或蛋白质分子结合的质子数，也就是正电荷数，由分子中所含碱性氨基酸（ARG，LYS，HIS）总数和N-端氨基决定。一般，天然蛋白和肽类中平均每十个氨基酸中就有一个碱性氨基酸，因此，一个20kDa的蛋白质在溶液中可接受1030个质子，20kDa的蛋白质在溶液中可接受的质子数量还会增多。在ESI MS分析中，这些离子沿着质量轴表现为不同丰度的分布，在正常情况下，这个分布应接近正态分布。,63
30、,蛋白质和多肽形成多电荷离子的特性使分析质量范围在24kDa（m/z）的四极杆和离子阱质量分析器可用于生物大分子的分离。,心肌红蛋白样品（分子量16952.48）生成的正离子ESI谱图中出现一系列从m/z7002400的多电荷离子(图5.26)。该谱图是用质量范围为4000的质谱仪测得。若样品只形成单电荷离子，它的分子量就超出了仪器的可测量范围。,65,14305.7,100,%,0,14150 14200 14250 14300 14350 14400 14450 14500 14550 14600,m/z,M/Z,1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 240
31、0,m/z,A131101.5,A121193.1,A111301.4,A101431.6,A91590.6,A81789.2,A72044.6,100,0,%,溶菌酶(lysozeme)14305.670.42,溶菌酶的ESI-MS质谱图,右上角的小图是溶菌酶的多电荷离子质谱图，大图是经“去卷积”数据处理的重组质谱图，溶菌酶的相对分子质量为14,305.7。从重组谱图中可以看出，该分子质量峰有一定的宽度，这是由于同位素峰的影响造成的。,66,串联质谱法（Tandem MS）,串联质谱法是将两个或两个以上的质量分析器串联在一起进行质谱分析的方法。又称为串级质谱法，质谱-质谱法，多级质谱法，二维
32、质谱法和序贯质谱法。作用：1、诱导第一级质谱产生的分子离子（称为母离子、parent ion，前体离子、Precursor ion）在第二级质谱裂解，得到更小的碎片离子（称为子离子，daughter ion、granddaughter ion、），进而给出该分子离子的更为丰富的结构信息。2、从干扰严重的质谱中抽取有用数据，大大提高质谱检测的选择性，从而能够测定混合物中的痕量物质。,67,用串联质谱分析肽序列和鉴定蛋白质,ESI-MS/MS测序的关键步骤是在多肽一级质谱的基础上，选择母离子（parent ion），通常是(M+H)+或(M+nH)n+，离子，使之进一步发生解离，得到更小的碎片离子
33、，根据碎片离子之间的质量差来“拼接”、“复原”肽类分子的构成，从而进行氨基酸序列的推测。,68,一个MS/MS分析的实验例-从HCC患者血浆中发现的差异蛋白峰经酶解后的肽混合物MS谱中，提取m/z为 420.8的母离子，再对该离子进行MS/MS分析的结果。,以b/y离子的信息，在UniProtKB/SWISS-PORT数据库中进行搜索，鉴定为芳香烃受体核转位蛋白2ARNT2蛋白（Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2，ARNT2）。表达该蛋白的基因在人类ORF数据库中被认为是HCC致病相关基因。,69,总结,以MALDI和ESI两种离子化技术为代表的生物质谱分析是蛋白质组学研究中最重要的支持平台之一。在蛋白质组学研究中，生物质谱可以完成三个方面的工作：蛋白质和多肽准确分子质量的测定；以MALDI TOF MS获得肽质量指纹图（PMF）；以ESI MS/MS获得串级质谱数据。获得准确的PMF和ESI MS/MS串联质谱数据后，再通过生物信息学数据库搜索蛋白质。在搜索没有有结果时，则要利用串联质谱数据，通过de novo策略或肽序列标签策略发现新的蛋白质。,70,复习题,1、质谱仪是由哪些部分组成的？2、简述以MALDI TOF MS获得PMF的分析流程。3、何谓串联质谱分析？,
