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1、第二节 细菌的群体生长繁殖,微生物的特点：,个体微小,除真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,一、生长曲线,生长曲线(Growth Curve)：,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。,一、生长曲线,一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期,细菌的生长
2、曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,（参见P130）,采用活菌计数比较麻烦，必需严格操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。,（参见P130）,迟缓期(Lag phase)：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。（参见P130倒数第一段）,迟缓期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大；细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和
3、ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。,以上特征说明细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子（分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等），种子老化（即处于非对数生长期）或未充分活化，接种时造成的损伤等。调整代谢需要一段适应期（P130倒数第一段）,调整代谢,迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。,在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：,（P130倒数第一段）,(1)通过遗传学方法改变种
4、的遗传特性使迟缓期缩短；,(2)利用对数生长期的细胞作为种子；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量,对数生长期(Log phase)or指数生长期(Exponential phase)：,以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定；是研究微生物基本代谢的良好材料；常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益,在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time)，在群体生长里细菌数量增加
5、一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。代时通常以G表示。,t1 t0,n,G=,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度 呈正比,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。,稳定生长期(Stationary phase)：,营养物质消耗，代谢产物积累、pH变化逐步不适宜于细菌生长生长速率降低直
6、至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。,生产上延长稳定期的方法：补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡,对数期到稳定期的转变是细胞重要的分化调节阶段：1）开始储存糖原等内含物；2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）；3）发酵过程积累代谢产物的重要阶段；某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期,获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物,稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关,衰亡期(Decline或Death phase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。死亡的细菌以对数方式增加，但由于部分细菌
7、产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，在死亡期后期仍会有部分活菌存在。（P131第四段）,特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物；如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊；有些革兰氏染色反应阳性菌此时会变成阴性反应,不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。,二、同
8、步培养,同步培养(Synchronous culture)：,使群体中的细胞进行同步生长培养技术,群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。,同步生长：,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,生理与遗传特性的研究；工业发酵的种子；,机械方法,离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法,环境条件控制技术,温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）,同步培养物：一种理想的材料,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。,三、连续培养,将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。,分
9、批培养（batch culture）or封闭培养（closed culture）,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,连续培养(Continous culture）,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法,培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。,生长：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期,控制连续培养的方法,恒浊连续培养,不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定,恒化连续培养,保持恒定的流速,（一）恒浊连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养
10、物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度低于预期数值时,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。,流速加快，使浊度降低,流速减慢，使浊度升高,当培养室中的浊度超过预期数值时,恒浊连续培养一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,（连续发酵）,连续发酵与单批发酵相比的优点：,缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,二）恒化连续培养,使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。,（参见 P 136）,通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物,多用于科研,遗传学：突变株分离；生理学：不同条件下的代谢变化；生态学：模拟自然营养条件建立实验模型；,恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其他营养物均过量。,（细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率）,限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度范围内能决定该机体生长速率。,
