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1、第四章病毒感染实验诊断,一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。,然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。,1.对潜伏期短，发病时尚无抗体产 生，可选择测定病毒颗粒、病毒 抗原或核酸。,2.对潜伏期超过十天的感染，可 检测特异性的IgM抗体来进行早 期快速诊断，及区别初次和再 次感染。,3.对可在体内形成持续感染或潜伏 感染的病毒，可检测急性期和恢 复期双份血清的IgG抗体有无4倍 以上升高，或直接检测病毒核酸。,4.对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同 时应采取双份血清以确认
2、分离 的病毒为病原体。,5.对同一症状可有多种病毒引起的 情况，应同时检测几种相关病毒 的病毒颗粒、抗原或抗体，6.对由多个型别组成的病毒可测定 它们的共同抗原。,第一节标本采集与运送,一、标本的采集1.采样时间 尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。,2.标本种类的选择 根据临床感染 的症状及流行病学资料，判断可 能感染病毒种类，选择相应部位 采取标本。,常见分离病毒标本的选择,3常见标本的采集方法,(1)血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100nml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病 毒、EBV、HIV-1及新生儿肠 道病毒。,(2)脑脊液：以无菌取脑脊液 12ml，冰浴
3、立即送检。在4可存放72h。用于分 离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。,(3)宫颈或阴道拭子：采取病灶部 位分泌物，或将拭子伸人宫颈 约lcm停留5秒取出，冰浴立即 送检。用于分离 HSV、CMV。,(4)粪便标本：取24粪便加 10ml运送液立即送检，用于 分离腺病毒、肠道病毒和轮 状病毒。,(5)含漱液：用无菌生理盐水让 患者含漱。用于分离流感病 毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。,(6)喉拭子：用压舌板避免唾液 污染，用拭子采取咽喉部表 面。用于分离腺病毒、CMV、肠道病毒、HSV、流感病毒等。,(7)尿道拭子及尿液标本：尿道拭 子伸人尿道4cm转动3次，以获 得较多的上
4、皮细胞，用于分离 CMV和HSV。(8)尸检标本：死亡后尽早采集各 种器官，分别使用器械和容器。,二、标本的运送和保存,病毒抵抗力弱，室温中容易灭活，用于分离培养的标本要尽快送检，4下数或-70。冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作保护。,病毒传送培养基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。为抑制细菌生长加青霉素100Uml和链霉素100gml，为了抑制真菌的生长加入25gml二性霉素B或40gml制霉菌素。,第二节 病毒分离与鉴定,一、病毒的分离方法1.组织细胞培养 根据细胞的来源、特性和传代次数分为：(1)原代细胞培养：将细胞悬液。加入营养液培养。形成的单 层细胞，称之为原代细胞。
5、,(2)二倍体细胞株：仍保持二倍体 特性。寿命一般为4050代，如人胚肺细胞。广泛用于病毒 分离和疫苗制备。,(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。,2鸡胚接种 鸡胚是用于分离粘 病毒科、疱疹病毒、痘类病毒 的较为理想的材料。,3动物接种 动物对病毒的敏感 性是不同的，选择合适动物十 分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。,常用于病毒分离的细胞,三、病毒的鉴定,必须通过全面了解其特性才能得到鉴定。1.根据临床特点，流行病学资 料，标本来源，大致了解病 毒的一些特性，有助于确认 病毒的种类。,2.动物
6、感染范围及特点 病毒感 染动物的范围、发病的潜伏期。3.细胞培养特点。综合上述资料作出鉴定。,病毒鉴定的方法,1.细胞培养的结果观察 病毒增殖后导致细胞发生:细胞病 变效应(CPE)。细胞肿大，变圆堆积 成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞 融合形成多核巨细胞，胞浆内或核内 出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；,不出现细胞病变现象。细胞培养液pH的变化。,2.中和试验,病毒与特异性抗体进行免疫反应，使病毒失去感染性，在细胞培养和活的机体内不出现病变的试验。常用细胞培养进行中和试验。如果特异性抗体能中和病毒，使之失去感染性，不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒，,用于病毒的分型诊断最具敏感和准
7、确性。也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体增加情况。,3.空斑或蚀斑形成试验 空斑是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，周围被活细胞包 围。一般而言，一个空斑是由一个感染 性病毒颗粒感染所引起的。不同的病毒 引起的空斑形态和大小不同。可进行病 毒颗粒的计数、纯化，结合中和试验可 进行病毒的鉴定。,4.干扰现象 某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰 以后进入的副流感病毒的增 殖，从而阻抑后者的红细胞 吸附作用。,5.红细胞吸附及吸附抑制试验,正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附鸡、豚鼠或猴
8、红细胞。,可作为初步鉴定。如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附抑制试验阳性，可作为病毒鉴定的依据。,4血凝试验及血凝抑制试验 某些病毒可与一定种类的哺乳 动物或禽类的红细胞产生血凝 现象。加入相应的血凝素抗体 可抑制血凝现象的发生，是为 血凝抑制试验。可作为病毒型 别确定的依据。,5病毒的大小及形态 可用电子显微镜观察病毒的 大小及形态。,6核酸类型鉴别及序列测定,利用5溴-2-脱氧尿苷(BUDR)抑 制DNA复制的特性，在细胞培养液中 加入该物质，可抑制DNA病毒的复制 和增殖，抑制细胞病变的出现，但对 RNA病毒无抑制作用，以此判断病毒 核酸类型。,
9、对病毒核酸特异序列或全序列的碱基排列测定或 DNA杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。,7耐酸试验 肠道病毒对酸有耐受力，而 鼻病毒在酸性环境下易被灭活。,8乙醚敏感试验 病毒外围如有类脂包膜，则易 被乙醚破坏，而失去感染性，不 能感染细胞。可作为病毒是否具 有类脂包膜的依据，也可用氯仿 或去胆酸钠代替乙醚进行试验。,9免疫荧光抗体染色 将感染细胞固定，用特异抗血 清荧光标记染色，在荧光显微镜 下，可见细胞内荧光，即可确定 型别。,第三节病毒感染快速诊断,通过测定病毒的特异标志成分，如特殊形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊断的重大发展。,一、形态学检查,1光学显微
10、镜 观察病毒感染细胞出现的包涵体。根据特点可作出辅助诊断。狂犬病 病毒在脑细胞出现嗜酸性的圆形或 椭圆形包涵体，称为内基小体。巨 细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出 现周围绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样 大型嗜酸性包涵体。,2电子显微镜检查(1)电镜直接检查：早期病毒感染标 本的病毒颗粒。如“秋季泻”患儿 粪便中的轮状病毒、甲肝患者粪 便中的HAV，疱疹病毒的疱疹液，HBV患者血清，均可观察到特征性 病毒颗粒。,(2)免疫电镜检查：在标本中加入 抗体。使病毒聚集成块负染观 察，更易发现病毒体，灵敏度 可提高100倍。,二、病毒抗原检测,病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特 异性抗原存
11、在，可以早期诊断 病毒感染。,1免疫荧光技术 适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流 感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检 组织中的肝炎病毒、神经组织中 的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂 犬病毒或其他脱落细胞和活检组 织中的病毒抗原检测。,2酶免疫技术 有酶免疫组化和 酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测 定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗 原(HBsAg)，HIV感染病人的P24 抗体等。,3.其他技术 如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记 的免疫层析技术等。,三、早期抗体检测,检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM可以快
12、速明确诊断各种病毒引起的新生儿先天性感染，测定HAV感染后抗HAV的IgM抗体可以明确诊断HA等。,四、病毒核酸检测,只要有完整的特异基因片段存在，就可进行诊断。,1斑点杂交法 将待测的DNA或RNA直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。用32p或131I同位素标记的探针通过放射白显影，可直接观察。现用地高辛、生物素等非同位素物质标记，然后采用酶反应或酶免疫技术进行检测，已被越来越多的实验室广泛使用。,2固相杂交技术 将核酸探针包被聚苯乙烯微孔 板中，加人待测的核酸序列和 标记的指示探针杂交液中进行 杂交，洗涤后，用酶免疫技术 进行检测。,3.原位分子杂交技术 在细胞原位暴露D
13、NA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。通过显色技术可显示特定杂交探针在细胞内的位置和核酸的数量。,4.Southern印迹和Northern印迹法 Southern印迹法用于DNA的杂交。提取 DNA,用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳 按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤 维膜上，用标记探针进行杂交。可以检 测病毒DNA特异序列。Northern印迹法用于RNA杂交分析。将 琼脂糖电泳后的RNA移至DBM膜上，用标 记探针进行杂交。用于检测RNA或mRNA。,5聚合酶链反应(PCR),选择病毒的特异保守片段作为靶基因，进行引物设计和扩增可诊断病毒性感染。选择病毒的易变区，结合RFLP，
14、测序等技术可以对病毒进行分型和突变的研究。,(1)DNA病毒：可直接进行PCR扩增 其特异片段。(2)RNA病毒：可通过RT-PCR技术，将RNA逆转录为cDNA，再进行 PCR扩增。,(3)定量PCR技术：对扩增的产物进 行原始标本定量，对病毒感染的 诊断起到了量化的作用。同时，对研究病毒和机体之间的关系提 供了参考。,有些病毒如轮状病毒的核酸具有典型的分节段特点。可以从标本中直接提取轮状病毒的核酸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，观察其特有的11个核酸节段的条带排列情况，进行诊断。,6病毒核酸的直接检测,五、病毒检验的结果评价,通过实验手段，从标本中获得有 关病毒感染的证据，从而确定病毒 感染和临床疾病之间的因果关系，是病毒实验诊断的目标。,通过分离和鉴定获得致病性病毒，发现病毒感染的特异征象，如机体内产生特异性抗体,急性期和恢复期血清中相应的特异性抗体有4倍以上的升高，细胞内包涵体的形成等,就可得出病原学诊断。,感染病毒的临床意义必须结合流行病学资料、临床表现、病毒种类及机体的病理变化作综合分析，才能判定。,
