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1、第二章 基因工程的基本条件,一、用于核酸操作的工具酶二、基因克隆载体三、目的基因的获得四、基因工程受体菌或细胞,三、目的基因的获得,限制酶酶切直接分离法PCR扩增法从mRNA合成cDNA化学合成法通过构建基因文库分离法,对已克隆在载体中的目的基因，可根据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适当的限制酶酶切，获得目的基因。,（一）限制酶酶切直接分离法,注意：,目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！,（二）PCR法扩增目的基因,利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。,PCR(polymerase chain
2、 reaction)：,以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。,双链DNA解链为单链DNA；,引物与模板单链DNA的特定互补部位配对、结合；,退火：,变性：,延伸：,变性,退火,延伸,30th cycle？,由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n(n为循环次数)。,230(109)copies,PCR技术的发明-DNA操作技术的革命,1983.03 开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路-DNA双螺旋 行驶的汽车-一小段DNA引物,1972 在加州大学伯克利分校获得博士学位1979 进入私人生物技术公司Cetus,1983.08 正式做有关PC
3、R原理的报告1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑,1985.03 Cetus公司申请专利 1985.12,Saiki RK,Scharf SJ,Faloona FA,Mullis KB,Horn GT,Erlich HA,Arnheim N.Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Scienc
4、e.1985,230(4732):1350-4.,1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会 1987.01,Mullis KB,Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction.Methods in Enzymology.1987,155:335-50.,1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司,1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶-Taq酶引入PCR技术。,Saiki RK,Gelfand DH,Stoffe
5、l S,Scharf SJ,Higuchi R,Horn GT,Mullis KB,Erlich HA.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science.1988,239(4839):487-91.,1988.01,1989 Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。,1986.09 Mullis离开Cetus公司,Eppendorf Bio-rad ABI,PCR法扩增目的基因的前提：,已知目的基因全序列或其两侧序列，化学
6、合成与模板互补的上、下游引物。,Taq酶无35外切酶活性，无阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配，30次循环Taq酶错配率约0.25。,措施：,问题：,可能造成目的基因碱基序列的改变。,原因：,选择高保真Taq酶，如Pfu。,因Taq酶对dATP具有优先聚合活性。,5,A,A,PCR扩增产物,5,由Taq酶扩增的PCR产物，3末端总是带有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几乎总是A，,（三）从mRNA合成cDNA,以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在Klenow酶作用下合成双链cDNA。,此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。,哺
7、乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA的90%以上。,目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。,目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%。,高丰度mRNA：,低丰度mRNA：,步骤：,钓取目的基因的mRNA：,1）提取特定组织或细胞的总RNA，用oligo(dT)纤维素柱分离总mRNA。,2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。,克隆平端双链cDNA的方法：,平端直接与载体连接；平端接同聚尾；加装人工接头(adapter)；加装衔接物(linker)。,加装同聚物尾：,利用TdT，在双链cDNA和载
8、体3端加互补的同聚物尾，退火连接成重组分子。,1972年，斯坦福大学P.Labban和P.Kaiser发明。,加装人工接头(adapter),1978年，康奈尔大学吴瑞发明。,将adapter连接到双链cDNA的两端，直接成为人工粘端。,CIP去除adapter的5-P，使5-P成为5-OH。,措施：,加装衔接物(linker):,linker是人工合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段。,EcoR I linker,将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性末端。,（四）化学合成法,已知目的基因的DNA序列。,化学合成法的
9、前提：,小片段粘接法补钉延长法大片段酶促法,战略：,化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。,1）小片段粘接法：,2）补钉延长法：,3）大片段酶促法：,化学合成的份额较大，成本较高。,大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅7.7%。,三种方法各有利弊：,化学合成DNA的单链片段愈短，收率愈高；,化学合成的份额较小，成本较低；,化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。,DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。,从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷
10、酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。,DNA合成仪,基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。,DNA化学合成的用途：,合成天然基因修饰改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探针制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker),合成天然基因：,有些组织特异性mRNA含量很低，很难用cDNA法克隆。,有些基因比较短，化学合成费用较低。,如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。,合成寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)：,根据已知核酸序列，用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片
11、段，作为探针使用。,若未知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考虑,密码子的简并性。,大多数氨基酸拥有简并密码子。,（五）通过构建基因文库分离目的基因,是特定生物体全基因组的集合（天然存在）。,基因库：,是从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在（人工构建）。,基因文库：,根据构建方法的不同，基因文库分为：,基因组文库：,cDNA文库：,含全部基因。,含全部蛋白质编码的结构基因。,鸟枪法构建；,材料来自染色体DNA；,cDNA法构建；,材料来自mRNA；,1、基因组文库,1、基因组DNA的制备：,制备的DNA分子量越大，切割后含不规则末端DNA片段的比率越低，重
12、组率和完备性越高。,基因组文库的构建,为最大限度保证基因的完整性，基因组DNA在分离纯化操作中应避免过度断裂。,常规方法制备的染色体DNA长度一般100kb，如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1,000kb的DNA片段。,一般采用超声波和限制酶部分酶切法。,保证DNA片段大小均一。,2、基因组DNA的切割：,保证DNA片段之间存在部分重叠区；,超声波处理：,处理后的DNA片段呈平末端，需加装人工接头。,产生粘性末端，可与常用克隆位点（如BamH I、Bgl II）连接。,部分酶切法：,部分酶切片段大小可控，可得到15-45kb的随机片断
13、；,3、载体和受体的选择,构建大型基因组文库（动植物和人类），选择BAC或YAC。,根据载体，选择E.coli、Yeast。,常选-DNA或Cosmid；,在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：,尽量提高载体与外源DNA片段的连接效率！,根据载体的装载量，将DNA片段分级分离；,利用CIP，去除载体的5-P；,利用TdT，在DNA片段的3-OH加同聚尾。,基因文库的完备性：,是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率P，与基因文库最低所含克隆数N的关系：,N=ln(1P)/ln(1f),P=基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）f=克隆片段平均大小/生物基因组大小,N=ln(1P)/ln(1
14、f),如：人单倍体DNA长2.9106kb，克隆片段平均大小15kb，构建完备性0.9的基因文库，至少需45万个克隆；当完备性提高至0.9999时，至少需180万个克隆。,即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，这时克隆片段总和为整个基因组的 倍。,9.3,即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，若1个基因文库的插入片段总和为整个基因组的10倍以上，就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。,基因文库的质量标准：,除尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：,重组克隆能稳定保存、扩增
15、、筛选。,克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；,载体的装载量必须大于基因的长度；,含有相邻DNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；,克隆片段易于从载体分子上完整卸下；,基因组文库的保存,影印滤膜保存法,保存文库于液体培养基中,保存单个克隆子于液体培养基中,1）影印滤膜保存法：,2）保存文库于液体培养基中,从平板上挑取全部克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，混合的细菌生长数代后，加入终浓度25%的甘油，-70保存。,缺点：由于文库菌落生长的不均匀性，可能导致文库中某些特定序列过多或过少。,3）保存单个克隆子于液体培养基中,从平板上挑选单个克隆，接种于含适当抗生素
16、的液体培养基中，菌体生长至一定浓度时，加入终浓度25%的甘油，-70保存。,缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。,从基因组文库中筛选目的基因,大型基因组文库由数十万甚至上百万个重组克隆组成，除一些具特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因）可用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选）直接筛选外，一般均需多轮操作步骤。,根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选,通过构建基因组文库获取目的基因的问题：,该方法仅适用于原核基因的分离，较少采用。,不能除去真核生物目的基因的内含子结构。,工作量大，需了解目的基因的背景知识；,不能获得最小长度的目的基因；,“鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹法”,用“鸟枪法”
17、获取目的基因：,缺点：,操作简便。,工作量大；具有一定的盲目性。,优点：,优点：保证目的基因的完整性，提高目的重组子 的出现频率，简化操作。,鸟枪法操作的改进：-使用特定限制酶完全酶切染色体DNA。,前提：已知目的基因的酶切图谱。,策略：用目的基因两端的限制酶完全酶切染色体 DNA，然后与载体拼接。,如：已知目的基因位于1.8kb的Sal I片段中，将染色体DNA用Sal I切开，琼脂糖凝胶电泳分离，切下区域内的凝胶块，从此凝胶中回收DNA片段，与载体连接。,基因组文库重组克隆的排序,构建大型基因组文库技术上并不困难，若文库插入片段总和为基因组的10倍以上，就能从其中调出任何一段DNA序列。,
18、然而基因文库的克隆是随机序列，必须将所有克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。-这项工作的工作量远大于文库构建。,酶切片段末端标记法随机探针联合杂交法染色体走读法,基因组文库重组克隆的排序方法：,酶切片段末端标记法：,1、将单一YAC克隆插入DNA片段用限制酶均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。,H,H,H,H,载体DNA,克隆DNA,2、然后用Sau3A将末端标记的DNA片段降解成碎片，PAGE电泳，每10个YAC克隆走在一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱。,3、电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上
19、则可能是排列一起的。,10克隆指纹图谱,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,随机探针联合杂交法：,1、将若干YAC克隆固定在薄膜上，复制20份薄膜；合成20种不同序列的短探针（序列随机）。,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A B C D E FG,2、用20种探针随机定位杂交（1对1）20份YAC克隆薄膜。若某2个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这2个克隆有可能相互重叠。,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,A
20、 B C D E FG,20个随机探针,3、若将杂交阳性结果记为“1”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。,01,02,03,04,05,06,07,08,09,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,D,A,B,C,E,F,G,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1、从基因文库中任取1个克隆作为染色体走读的起点，将其两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5-2.0kb范围内。,染色体走读法(chromosome walking)：,走读的起点克隆片段,亚克隆旁测序列
21、,2、以亚克隆DNA片段为探针，与基因文库杂交，阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起。,3、再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点。,阳性克隆,阳性克隆,第二轮杂交,第二轮杂交,将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群体。,2、cDNA文库,信息量远小于基因组文库，容易构建；,具有时空性和组织细胞特异性。,cDNA文库的特点：,不含内含子序列；,可以在细菌中直接表达；,包含该生物全部蛋白质编码的结构基因；,在高度分化的生物体中，不同组织或细胞在相同时段、相同
22、环境背景下，mRNA种类、表达水平也不同。,同一组织或细胞在不同时段、不同环境背景下，mRNA种类、表达水平不同。,具有时空性和组织细胞特异性：,cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此具有时空性和组织细胞特异性。,cDNA文库的构建,总RNA提取,1）总RNA提取：,商业化试剂盒。,利用mRNA含polyA尾，将其从总RNA中分离纯化，mRNA只占总RNA的1-2%。,2）mRNA的分离纯化：,商业化oligo(dT)纤维素柱。,哺乳动物mRNA长度为，大部分为。,3）cDNA第一链的合成：,cDNA第一链,mRNA,AAAAAAAAAAAAAA 3
23、,AAAAAAAAAAAAAA 3,TTTTTTTTTTTTTTT 5,AAAAAAAAAAAAAA 3,TTTTTTTTTTTTTTT 5,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,4）cDNA第二链的合成,自身引导法,置换合成法,引导合成法,自身引导法：,获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失。,置换合成法：,TTTTTTTTTTTTTT 5,获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失。,引导合成法：,获得的双链cDNA能保留完整的5端序列。,载体和受体的选择,选择E.coli。,选择plasmid。因绝大多数真核生物的mRNA10kb。,受体：,载体：,从cDNA文库中筛选目的基因,根特异性表达的目的基因差显杂交筛选法示意图,通过构建cDNA文库获取目的基因的问题：,仅限于克隆蛋白质编码基因。,并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；,细菌等原核生物的mRNA半衰期很短；,mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极敏感，分离纯化困难；,
