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1、流式细胞术在白血病中的临床应用,新疆自治区人民医院检验科莫红梅,一、简介流式细胞术二、简介白血病三、流式细胞术在白血病中的应用(结合病例分析),一、简介流式细胞术,1.流式细胞术（flow cytometry,FCM）：以流式细胞仪测量悬浮细胞的一种现代细胞分析技术。综合运用电子、激光、计算机和流体力学等与荧光标记、分子免疫学、分子遗传学及分子生物学等结合，对细胞的生理功能和特性进行分析。,散射光信号,Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incide
2、nt Light Source,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性,Laser,FALS Sensor,流式细胞仪的检测信号,荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,双色直接染色,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,二、简介白血病,造血干细胞分化过程的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤。,1.白血病：常见的恶性肿瘤之一,根据白血病细胞的成熟程度和自然病程：,急性：原始
3、细胞、早期幼稚细胞为主，自然病程仅数月慢性：较成熟幼稚细胞和成熟细胞为主，自然病程常为数年,淋系、髓系（单核和粒细胞）急淋、急非淋（急性髓系白血病）慢淋、慢粒,根据主要受累的细胞系可分：,2、白血病的病因,放射因素化学因素病毒因素遗传因素其它血液病：慢粒、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、MDS、PNH、淋巴瘤、MM,3、发病率,占癌症发病率的5%，我国发病率2-4/10万，美国9.6/10万，欧洲万。,我国白血病的流行现状及特点,急性：慢性5.5：1急性髓系白血病最多，其次急淋、慢粒，慢淋少成人急白以急粒为多见儿童以急淋为多见慢粒白血病随年龄增长发病率逐渐升高慢淋在50岁以后
4、才明显增多男性略高于女性1.18：1,现有的分型：,FAB1976年形态分类1985-1986MIC:MorphologyImmunology Cytogenetics WHO1995-1997细胞遗传学NCI1990,FAB1991年修订：急性髓系白血病,M0 急性髓系白血病微分化型M1急性粒细胞白血病未分化型M2急性粒细胞白血病部分分化型M3急性早幼粒细胞白血病M4急性粒单核细胞白血病M5急性单核细胞白血病M6红白血病M7急性巨核白血病,急性淋巴细胞白血病,B细胞系T细胞系,4、临床特点,起病：发病急骤或缓慢起病急者往往可没有前驱症状，突然发病，以发热、多部位出血、进行性苍白或骨、关节疼痛
5、等为首发症状。起病缓慢者以苍白、乏力、虚弱和食欲减退等症状开始，可进行性加重，以后多有发热、出血等。,发热是最常见症状。感染原因：中性粒细胞减少或缺乏；中性粒细胞功能异常；免疫功能尤其是细胞免疫功能低下，或化疗、糖皮质激素的应用；白血病细胞在全身各脏器广泛浸润，尤其是高白细胞浸润后使组织缺氧，局部组织出血、坏死，增加了细菌滋生机会。抗生素的使用不正确，尤其是条件致病菌及真菌的感染,发热和感染,急白：几乎所有患者都有不同程度出血，其中以M3和M5出血重。慢性白血病:不常见原因：血小板质和量异常DIC:M3易发生凝血因子缺乏,出血,原因：骨髓中红细胞系的造血被白血病细胞增殖所替代或受到白血病细胞分
6、泌的抑制因子所抑制，使骨髓中红细胞的生成减少，并使幼稚红细胞对红细胞生成素的反应减弱。无效红细胞生成；幼稚红细胞增生异常。溶血：多见于ALL、CLL,急白合并DIC时常有微血管病性溶血。其它：急慢性失血及某些抗代谢化疗药物,贫血,白血病细胞大量繁殖，使骨髓内张力增高而发生疼痛；白血病细胞也可浸润骨皮质和骨膜，发生局部肿块，还可以引起骨皮质破坏缺损引起疼痛；白细胞坏死引起高尿酸血症致痛风、融骨性粒细胞肉瘤等，均可引起骨痛。肢体剧烈疼痛多见于ALL,儿童白血病多浸润关节，成人主要疼痛部位在胸骨、肋骨及脊椎等。,骨、关节疼痛,神经系统白血病细胞常可侵及中枢神经系统，以蛛网膜及硬脑膜的浸润常见。,消化
7、系统消化道的出血常见,肝、脾、淋巴结肿大急白的淋巴结肿大多为表浅的轻度肿大，质地较软，多局限在颌下、颈部、腹部及腹股沟等处。绝大多数T-ALL有纵膈淋巴结的肿大，但较少引起气管、颈静脉压迫等症状。巨脾主要见于CML晚期及其急变、幼淋巴细胞白血病。,呼吸系统肺部浸润以AML多见，侵犯胸膜发生胸腔积液以ALL多见，亦可见于AML-M5,多为血性，可见较多白血病细胞。,泌尿系统,心脏五官及口腔白血病细胞浸润口腔黏膜可引起牙龈肿胀增生、巨舌、牙龈出血及口腔溃疡，以AML-M4和M5最常见；眼眶与球后为绿色瘤的好发部位。乳腺 绿色瘤 常见于儿童和青年AML患者，尤以M2b多见，少数以绿色瘤为首发。绿色瘤
8、浸润之处皆呈绿色，是由于含大量的过氧化物酶所致。,电解质紊乱低钾血症是AML于ALL常见的并发症，于溶菌酶增高有关，血及尿中溶菌酶增高损伤肾小管，使近曲小管功能不全，钾离子排出增多。低钠血症高钾血症低钙血症高磷血症,3.流式细胞免疫分型的发展史,1968年第一台流式细胞仪 美国斯坦福大学80年代中期MIC分型我国：1988年北京大学人民医院购入1990年白血病免疫分型临床应用,二、FCM在白血病诊断、治疗中的应用,白血病分型是白血病的诊断、选择化疗方案、判断预后的重要依据,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,1.CD45的临床应用,CD45是白细胞的共同抗原成分。其分子量介于1802
9、20Kda之间，属于T200家族。所有人类白细胞均表达CD45，包括淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞、胸腺细胞、脾细胞、扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞。,造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关,即：分化程度高的细胞CD45表达量高，分化程度低的细胞CD45表达量低（淋巴细胞单核细胞成熟粒细胞原幼细胞，在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞单核细胞原幼细胞淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45SSC设门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,2.FCM在白血病中的
10、应用优势,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7诊断双系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病（如HCL）,正常BM各系细胞比率,淋巴20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;单核2-6%粒细胞:40-60%有核红:20-25%,急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）R2：95.15%，CD33,HLA-DR,CD19,CD22,CD10 阳性,正常B细胞标志,泛B标志：CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22幼稚B标志：CD34,TdT,CD10成熟B标志：CD23,FMC
11、7,B-ALL的分型,2个月后复查:R3:73.94%CD33,HLA-DR,CD19,CD22,CD10,CD34阳性,R2：15.14%CD33,HLA-DR,CD19,CD10,CD34,CD22阳性，部分细胞表达CD20,急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图,正常T细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分类,T-ALL的分型,预后,B-ALL及急性早期B前体细胞白血病的预后差，C-ALL的预后较好。T细胞系ALL的预后一般讲，小儿T细胞系ALL预后较差，而成人此型的预后较好。染色体分析对ALL尤其是儿童ALL有重要的预后价值。混合型CLL预后及治疗效果比CLL差。,正常单核
12、细胞标志,全单核细胞标志：CD33,CD13,HLA-DR幼稚单核细胞标志：CD34,CD117成熟单核细胞标志：CD14,CD64,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,正常粒细胞标志,成熟粒、单核细胞主要区别,成熟粒细胞：CD33+HLA-DR-CD14-CD64+dim成熟单核细胞：CD33+HLA-DR+CD14+CD64+,R2:48.18%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD14,CD64,CD11b,CD13阳性，部分细胞表达CD117,R3:44.36%CD33,HLA-DR,CD34,CD15,CD117,CD38,CD13阳性,病例一,某男，49岁，汉，以“咳嗽、咳
13、痰、气短40天”为主诉入院。血常规：WBC:33.5109/L,HB 62g/L,RBC 1.871012/L PLT:51109/L,N 4.3%,L 90%M 5.4%,骨髓白血病免疫分型结果：,R1:98.80%阳性表达：CD33:87.36%,CD13:46.67%,CD38:22.68%CD34:92.49%,HLA-DR:83.99%,CD19:98.08%,CD10:58.70%,CD20:34.09%,CD22:54.92%,骨髓形态：有核细胞增生活跃，粒系增生受抑制，红系增生活跃，淋巴细胞增生明显活跃，占81%，其中原始及幼稚淋巴细胞分别占10%和58%。,治疗一个疗程(长春
14、地辛+去甲氧柔红霉素+地塞米松)后复查骨髓免疫分型,R2:83.14%阳性表达：CD33:99.53%,CD13:56.26%,CD38:24.47%CD34:98.44%,HLA-DR:99.68%,CD19:99.39%,CD10:99.42%,CD20:54.47%,CD22:84.24%,第二个疗程加用阿糖胞苷，2个月后复查骨髓免疫分型（急性白血病双表型）,病例二,某男，21岁，哈族，以“间断发热，伴头晕、乏力一个月”为主诉入院。查体：重度贫血貌，右侧腹股沟处触及2个0.5*1cm大小淋巴结，边清，活动可，质中，无压痛，余（-）T：39.6，WBC:1.3109/L,HB 73g/L,
15、PLT:94109/L,骨髓免疫分型,形态：有核细胞增生极度活跃，粒系增生极度活跃，占96%，以异常早幼粒细胞增生为主。诊断：M3a,6个月后复查：,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,某男，73岁，汉，以“发现双侧颈部淋巴结肿大1周”为主诉入院。血常规：WBC:6.49109/L,HB 80g/L,PLT:214109/L,N 57.1%,L 33.4%M 7.9%,IgM 32.3g/L,病例三,骨髓白血病免疫分型结果：,R1：61.41%阳性表达：CD19,CD22,HLA-DR,CD20,CD38,FMC-7,CD23,CD5,病理结果：B小淋巴细胞淋巴瘤注意与
16、其它慢性B淋巴细胞增殖性疾病的鉴别,病例四：多毛细胞白血病,典型为外周血全血细胞减少，脾大。血涂片中细胞具有明显的特征：为中等大小的淋巴细胞，核/质比中等。胞质亮蓝，边缘不清，具有细且不规则的“毛”状胞质突起。,R2:14.60%CD19,CD103,CD20,CD22,HLA-DR,FMC-7,CD23,CD25阳性,诊断白血病主要标志：,B-ALL:CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL:CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML:CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO M2:CD19+:t(8,21)M3:CD34
17、-,HLA-DR-M4/M5:CD14+M6:GlyA+,CD71+M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+,免疫分型对下列情况具有重要意义,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。慢性淋巴细胞白血病。微小残留白血病。,原始细胞90%，胞浆大多透亮或中度嗜碱，无嗜天青颗粒及Auer小体，核仁明显，类似All-L2型；细胞化学过氧化物酶及苏丹黑B染色3%；CD33或/及CD13阳性。淋系抗原阴
18、性，但可有CD7+、TdT+；电镜过氧化物酶阳性。,M0,原粒细胞（+型）90%(NEC),早幼粒细胞很少，中幼粒细胞以下阶段不见或罕见。,M1,M2,M2a 骨髓中原粒细胞为30%-10%M2b骨髓中原粒、早幼粒细胞增多，以异常的中性中幼粒细胞增生为主，其胞核常有核仁，有明显的核浆发育不平衡，此类细胞30%.,M3,以颗粒增多的异常早幼粒细胞增生为主，30%(NEC),其胞核大小不一，胞浆中有大小不等的颗粒：M3a 粗颗粒型M3b 细颗粒型,M4,M5,M5a 未分化型：骨髓中原单核细胞+（NEC)80%M5b 部分分化型：骨髓中原始+幼稚单核细胞（NEC)30%，原单核细胞+80%,M6,
19、骨髓中红细胞系50%，且有形态学异常，骨髓原粒细胞（NEC）或原始+幼稚单核细胞（NEC）+型30%；若血片中原粒细胞或原单核细胞5%,骨髓原粒细胞或原始+幼稚单核细胞20%(NEC),M7,外周血中有巨核细胞；骨髓中原巨核细胞30%，该原巨核细胞应有电镜或单克隆抗体证实；骨髓细胞少，往往干抽，活检有原始和巨核细胞增多，网状纤维增加。,关于双系与双表的定义,双表型：白血病细胞均一，每个细胞能同时表达淋巴系细胞及髓系细胞标记。双系型：白血病细胞不均一，部分细胞表达淋巴系细胞标志，另一部分细胞表达髓系细胞标志。在同一患者可见到淋巴细胞系及髓系细胞形态的白血病细胞。,“好好的病理学家被淋巴瘤毁了！”,病理学家高子芬,Thank you!,
