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1、第三章,紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry;UV-vis),研究物质在紫外-可见光区（200-800nm）分子吸收光谱的分析方法。,第一节 紫外-可见分光光度法的基本原理第二节 紫外-可见分光光度计第三节 紫外-可见分光光度分析方法,本章提要：,第一节 紫外-可见分光光度法的基本原理,一、有机化合物的吸收光谱,UV-Vis光谱是分子中的价电子在分子轨道之间的跃迁而产生（包括振动和转动能级的跃迁）。有机化合物中有几种性质不同的价电子，有机化合物的UV-Vis光谱吸收光谱是三种电子跃迁的结果：电子、电子、n电子跃迁,根据分子轨道
2、理论，分子中的电子轨道有 n、和 三种,分子轨道可以认为是两个原子轨道线性组合而生成的两个分子轨道。能量低的为成键轨道，能量高的为反键轨道。,两个原子的s轨道“头碰头”结合组成的分子轨道为 成键轨道和反键轨道。同理，两个原子的p轨道“肩并肩”重叠组成的分子轨道称成键轨道 反键轨道。,键电子云重叠比键电子重叠少，键能弱，跃迁所需的能量低。,分子中n电子的能级基本上保持原来原子状态的能级，称为非键 轨道。比成键轨道所处能级高，比反键轨道能级低。,当分子外层电子吸收紫外可见辐射后，处于低能级的价电子就会跃迁到较高能级。主要有四种跃迁，所需能量E大小顺序为：n n,*跃迁,甲烷125 nm乙烷135
3、nm,所需能量最大；电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁,吸收光谱处于远紫外区，多为饱和烃。,n*跃迁,所需能量较大，但小于*跃迁；含有未共用电子对（n电子）原子的饱和化合物都可发生,如含杂原子的分子：-NH2、-OH、-S、-X中的未成键的n电子吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区跃迁的吸收系数较低比较小，一般在100-3000 L/mol cm,H3C-O-H,例:甲醇的吸收峰，除*跃迁外，还有n跃迁（吸收波长在183nm，=150 Lmol-1cm-1）,n 跃迁,所需能量小；多发生在含杂原子的双键化合物：-C=O、-C=N、-C=S、-N=N-，即分子中含有孤对电子和键同时存
4、在时，才发生n 跃迁；吸收波长为200400nm，一般在近紫外区；吸收系数较低,例:丙酮有280nm左右的n 跃迁吸收峰（=1030 Lmol-1cm-1）,跃迁,所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区含有不饱和键的有机分子易发生这类跃迁 属于强吸收，max 104Lmol-1cm-1，具有共轭双键的化合物 跃迁所需能量降低,例:乙烯*跃迁的max=165nm,=1x104 Lmol-1cm-1丁二烯的*跃迁的max=217nm,=2.1x104 Lmol-1cm-1,有机化合物的紫外-可见吸收光谱分析多以*和 n*这两类跃迁为基础,*比 n*跃迁几率大100-1000 倍*跃
5、迁吸收强，104 n*跃迁吸收弱，500,二、无机化合物的吸收光谱,无机化合物的UV-Vis光谱吸收光谱主要有：电荷迁移跃迁及配位场跃迁,配位场跃迁（d一d、f 一f 跃迁）,在配体存在下过渡金属元素5个能量相等的d 轨道和镧系、锕系7个能量相等的的 f 轨道裂分，吸收辐射后，低能态的d电子或f电子可以跃迁到高能态的d或f轨道上去。绝大多数过渡金属离子都具有未充满的 d 轨道，按照晶体场理论，当它们在溶液中与水或其它配体生成配合物时，受配体配位场的影响，原来能量相同的 d轨道发生能级分裂，产生 d-d 电子跃迁。必须在配体的配位场作用下才可能产生，所以称为配位场跃迁；配体配位场越强，d 轨道分
6、裂能越大，吸收波长越短。吸收系数 max 较小(102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物结构及其键合理论。,d 轨道电子云分布及在配场下的分裂示意图,例如：H2O 配位场 NH3 配位场Cu 2+水合离子 794 nmCu 2+氨合离子 663 nm,电荷迁移跃迁,辐射下，分子中原定域在金属M轨道上的电荷转移到配位体L的轨道，或按相反方向转移，所产生的吸收光谱称为电荷迁移光谱。,分子内氧化还原反应；不少过渡金属离子与含生色团反应的试剂所生成的配合物可产生电荷迁移跃迁，Fe2+与邻菲罗啉配合物的紫外吸收光谱属于此。max 较大(104以上)，可用于定量分析。,三、紫外-可见吸收光谱常用概念,
7、物质对光的选择性吸收及吸收曲线,M+热,M+荧光或磷光,E=E2-E1=h 量子化，选择性吸收,M+h M*,基态 激发态E1（E）E2,吸收曲线（吸收光谱）：是以（nm）为横坐标，以吸光度为纵坐标所描绘的曲线。,吸收曲线与最大吸收波长 max可用不同波长的单色光照射，测吸光度得到扫描,同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处称为吸收峰，所对应的波长称为最大吸收波长max,不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,吸收曲线可以
8、提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。,生色团（Chromogenesis group）：分子中含有非键或键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起n-*和-*跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。,C=C 生色团,简单的生色团由双键或叁键体系组成，如 C=C、-CC-C=O、-NO2、C=S、偶氮基 N=N-、腈基-CN,助色团（Auxochromous group）：含有孤对电子的杂原子饱和基团（如-OH、-OR、-NH、-NHR、-SH、-SR、-X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n*共轭作用，增强生色团的生色能力(
9、吸收波长向长波方向移动)并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。,270,苯（*）,苯酚（OH为助色团）,/nm,红移或蓝移（Redshift or blueshift）：有机化合物的吸收谱带常常因发生共轭作用、引入助色团或改变溶剂,使最大吸收波长max和吸收强度发生变化:max向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。,增色与减色效应,吸收强度即摩尔吸光系数增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应。,强带与弱带,max104max102,促使分子发生红移或蓝移的因素有哪些呢？,共轭效应：电子共轭体系增大，波长红移、吸收增强,如CH2=CH2的-*跃迁，max=165200
10、nm；而1,3-丁二烯，max=217nm,，max,当有5个以上共轭双键时，吸收带已落在可见光区,取代基,取代基含孤对电子，如-NH2、-OH、-Cl，可使分子红移；取代基为斥电子基，如-R，-OCOR，则使分子蓝移。,pH值,苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm两个吸收带；而在碱性溶液中，则分别红移到235nm和 287nm（p-共轭）.,溶剂效应,由n-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，非键电子形成 H 键的能力增加，使基态能量的降低大于反键轨道与极性溶剂相互作用所降低的能量，因而跃迁所需能量变大，发生蓝移；由-*跃迁产生的吸收峰，随溶剂极性增加，激发态比基态能量有更
11、多的下降，发生红移。,四、吸收带及其与分子结构的关系,1.R带 n 2.K带 3.B带4.E带5.电荷转移吸收6.配位场吸收,吸收峰在紫外/可见光谱中的位置,/nm,log,电荷转移,配位场跃迁,种主要吸收带在紫外-可见吸收光谱中的位置,苯：E1带：180184nm；=47000E2带：200204 nm=7000 苯环上三个共扼双键的*跃迁特征吸收带；,B带：230-270 nm（精细结构）=200*与孤立苯环振动引起（苯蒸气）；含取代基时，B带简化，红移。,五、影响吸收带的因素,1.位阻影响,顺反异构：顺式：max=280nm；max=10500反式：max=295nm；max=29000
12、,2.跨环效应,在、不饱和酮当中，双键与酮基无共轭体系(n,p),适当的立体排列，羰基氧的孤对电子和双键的电子发生作用，有：n p*的 R带，向长波移动,轨道与杂原子的轨道交盖，出现跨环效应,3.溶剂的影响,改变溶剂的极性会引起吸收带max 发生变化，因此在测定UV-Vis光谱时，要注明所用溶剂。,n*跃迁：兰移；,*跃迁：红移；,位移原因：极性溶剂对 n、和*轨道的溶剂极化作用不同所引起的。极性：n*,极性最大，溶剂化最强，能量下降最多,极性最小，溶剂化最弱，能量下降最少,溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响,溶剂的极性除了影响吸收峰的位置，还影响吸收光谱的精细结构：,蒸汽中,环己烷,
13、水中,对称四嗪,极性溶剂使精细结构消失,4.体系pH的影响,pH影响吸光物质的存在形态，产生不同的吸收光谱如苯酚，在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm两个吸收带；而在碱性溶液中，则分别红移到235nm和 287nm,(一)LambertBeer定律 LambertBeer定律是吸收光度法的基本定律；说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和厚度间关系的定律。Beer定律说明吸光度与浓度的关系，Lambert定律说明吸光度与厚度的关系。光束在每单位时间内所传输的能量或光子数是光的功率(辐射功率)，可用符号P表示。在光度法中，习惯上用光强这一名词代替光功率，并以符号I代表。,六、L
14、ambert-Beer定律,假设一束平行单色光通过一个含有吸光物质的物体，截面积为s，厚度为l，见图。物体中含有n个吸光质点(原子、离子或分子)。光通过此物体后，一些光子被吸收，光强从I0降低至I。,如物体中一个极薄的断层中所含吸光质点数为dn，这些能捕获光子的质点可以看作截面s上被占去一部分不让光子通过的面积ds，即：dskdn,光子通过断层时，被吸收的几率是：因而使投射于此断层的光强Ix被减弱了dIx，所以：由此可得，光通过厚度为l的物体时，有：又因截面积s与体积V，质点总数n与浓度C等有以下关系：,上式中I/I0是透光率(transmitance，T)，常用百分数表示；又以A代表-lgT
15、，并称之为吸光度(absorbance)，于是：单色光通过吸光介质后，T与C或l之间呈指数函数关系。A与这两个参数呈正比关系，其中E是比例常数，称为吸光系数(absorptivity)。吸光系数表示吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。在给定单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。物质吸光系数愈大，表明该物质的吸光能力愈强，所以吸光系数是定性和定量依据。,吸光系数，常用的有两种表示方式：1摩尔吸光系数：在一定波长时，溶液浓度为1mol/L,厚度为1cm的吸光度。2百分吸光系数(或称比吸光系数)吸光系数：在一定波长时，溶液浓度为1%（W/V），
16、厚度为1cm的吸光度。两种表示方式之间的关系是：其中，M是吸光物质的摩尔质量。一般不超过105数量级，104105之间为强吸收，小于102为弱吸收，介于两者之间称中强吸收。,吸光系数 或 不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测得吸光度换算而得到。例如氯霉素(M为323.15)的水溶液在278nm处有吸收峰。设用纯品配制100ml含有2.00mg的溶液，以l.00cm厚的吸收池在278nm处测得透光率为24.3。则：,例题：已知含铁（Fe2+）为1.0mg/mL的溶液，用邻二氮菲分光光度法测定。吸收池厚度为2cm，在510nm处测得其透光率为0.417，求吸光度A及摩尔吸收系数（Fe2+的摩尔
17、质量为55.85g/mol）。,A=-lgT=-lg 0.417=0.380,c=1.0 10-3/55.85=1.8 10-5 mol/L,510=A/bc=0.380/21.810-5=1.06 104 L/molcm,吸光度的加和性：,七、偏离Beer定律的因素,比尔定律本身的局限、实验条件的因素（化学偏离和光学偏离）,（一）比尔定律本身的局限,比尔定律只适用于稀溶液，是一个有限定条件的定律。在浓度高于0.01mol/L时，吸收组分间平均距离减小，电荷分布改变，发生改变，吸收给定波长的能力改变。,（二）化学偏离,分析物质与溶剂发生缔合、离解或溶剂化，产物与被分析物具有不同的吸收光谱。例如
18、亚甲蓝阳离子水溶液中单体和二聚体的吸收峰分别在660nm和610nm处，随着浓度的增大，660nm处吸收峰减弱；而610nm吸收峰增强，使吸光度与浓度关系发生偏离。,亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱(a)6.3610-6mol/L(b)1.2710-4mol/L(c)5.9710-4mol/L,（三）光学偏离,吸收定律只适合单色光。但由于仪器分辩能力所限，入射光实际为一很窄波段的谱带，即在工作波长附近或多或少含有其他杂色光。这些杂色光将导致朗伯-比尔定律的偏离。,（四）透光率测量误差：,A=E b c,当浓度相对误差 c/c 最小时，求得T=0.368 或 A=0.434。即当A=0.434 时，
19、吸光度读数误差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.20.7范围内。,第二节 紫外-可见分光光度计,UV-Vis spectrometer,一、主 要 部 件,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,1.光源,在整个紫外光区和/或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500nm 紫外光区：氢、氘灯，发射波长范围在185400nm,D2 灯,H2 灯,200 250 300,/nm,相对辐射功率,2.单色器,入射狭缝：光源的光由此进入单色器；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；,色
20、散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；出射狭缝。,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出任一波长单色光的光学系统。,3.样品室,又称吸收池放置各种类型的比色皿和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池,4.检测器,利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管（CCD）。,检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,文件存储、峰形处理、对数或微积分函数运算、,5.结果显示记录系统,二、分光光度计的类型 types of spectro
21、meter,1.单光束分光光度计从光源到检测器只有一束单色光。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度A/T，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性,（一）几种光路类型,准直镜,测量方便，不需要更换吸收池 减少了光源强度不稳定性的影响 实现了快速自动吸收光谱扫描,2.双光束分光光度计,旋转扇面镜，单色光被旋转扇面镜分成交替的两束光，分别通过样品池和参比池,将不同波长的两束单色光(1、2)快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,3.双波长分光光度计,通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光
22、度差A。AB1和AB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2 相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。特点：不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)。,单光束 双光束（空间分隔）双光束（时间分隔）特点：因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。,4.多光道二极管阵列检测的分光光度计,光经全息光栅表面色散并投射到二极管阵列检测器上，可在极短的时间内获得180820nm的全光光谱。,二极管阵列分光光度计光路图l.光源：钨灯或氘灯 2，5.消色差聚光镜 3光闸 4吸收池 6入口狭缝 7全息光栅 8二极管阵列检测
23、器,第三节 紫外-可见分光光度分析方法,一、定性分析 qualitative analysis,有机化合物对紫外光具有吸收光谱特征：形状、峰的数目、波长位置及max（化合物特性参数），可作为定性依据,反映结构中生色团、助色团特性，不能够完全反映分子特性。结构相同的化合物一定具有相同的吸收光谱，但吸收光谱相同的却不一定是相同的化合物,对比法：试样与其标准品或标准谱图库：46000种 The sadtler standard spectra,Ultraviolet,1.对比吸收光谱特征数据：,2.对比吸光度的比值：,3.对比吸收光谱的一致性：,max：是特征常数而加以区别,max：峰、峰数、峰肩和
24、峰谷,我国药典VB12的鉴别：1.701.88=A361/A278；3.153.45=A361/A550,同样条件下，Overlay,二、单组分的定量分析,依据Beer定律：A=c b，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成正比,波长选择：无干扰处的max处，一般躲开短波端的吸收峰，注意溶剂本身的吸收,1.吸光系数法（绝对法）：,、a或E可从手册查到注意：当单色光不纯、仪器型号的差异等会带来较大误差,2.校正曲线法（相对法）：,固定仪器、工作条件和测定条件，用待测物质的标准品配制一系列浓度不同的标准溶液，绘制Ac标准工作曲线。在相同条件下测定样品溶液的A，从曲线上查或用线性方程计算样品溶液的c,
25、Y=0.010+0.091X，R=0.9996,4.895mmol/L,3.对照法（相对法）：,固定仪器、工作条件和测定条件，分别测量Ax和As：As=b cs Ax=b cx,四、紫外吸收光谱法用于有机化合物 分子结构的研究,有机化合物的紫外吸收光谱可获得的结构信息,（4）共轭体系：200-250nm有强吸收峰(104)，K带230nm 大键，红移并吸收增强。-不饱和醛酮：K带240nm，R带310-350 nm。,（1）200-400nm 无吸收峰：饱和化合物，单烯,（2）含孤立助色团的饱和有机化合物：n*红移,（3）含孤立生色团的有机化合物：n*n*,醛、酮 n*跃迁产生的R带,确认ma
26、x，并算出，初步估计属于何种吸收带；观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；(3)了解溶剂的极性与pH值的影响,光谱解析注意事项,（5）芳环的特征吸收：具有精细结构的特征 B 带，还有E1和E2带。苯环增加取代基后，红移并吸收增大。吸电子基和斥电子基有所不同 助色团和生色团也不同,(4)立体结构和互变结构的确定,顺式：max=280nm；max=10500反式：max=295.5 nm；max=29000共平面产生最大共轭效应，max大,互变异构：,酮式：max=204 nm；无共轭 烯醇式：max=243 nm,课 堂 练 习,()1.溶液的透光率随着溶液浓度的增大而减小，所以透光率与溶
27、液的浓度成反比关系。()2.在分光光度法中，测定所用的参比溶液总是采用不含被测物质及显色剂的空白溶液。()3.在分光光度测定中，根据在测定条件下吸光度与浓度成正比的朗伯-比尔定律的结论，被测定溶液浓度越大，吸光度也越大，测定结果也就越准确。,x,x,x,1.可见紫外分光光度法的适合检测波长（nm）范围是a.400760 b.200400 c.200760 d.20010002.有A、B两份不同浓度的有色物质溶液，A溶液用1.0cm吸收池，B溶液用2.0cm吸收池,在同一波长下测得的吸光度的值相等，则他们的浓度关系为 a.A是B的1/2 b.A等于B c.B是A的2倍 d.B是A的1/23.某被
28、测物质的溶液50mL，其中含有该物质0.10mg，用1.0cm吸收池在某一波长下测得百分透光率为10%，则质量吸光系数L/g cm为 a.1.0102 b.2.0102 c.5.0102 d.1.0103,1.吸光度用符号_表示，透光率用符号_表示，吸光度与透光率的数学关系是_ _。2.分光光度计的种类繁多，但都是由下列主要部件组成的：（1）_、（2）_、（3）_、（4）_、（5）_。,4.在吸光光度法分析中，当液层厚度为d 时，溶液的透光率和吸光度分别为T和A。若其它条件不变，当液层厚度为2d时，溶液的透光率和吸光度分别为：A.T/2，2AB.T2，A/2 C.T/2，A/2 D.T2，2A,称取维生素C 0.05g，溶于100mL的稀硫酸溶液中，再量取此溶液2.0mL准确稀释至100mL。取此溶液在1cm厚的石英池中用245nm波长，测定其吸光度为 0.551，求维生素C的百分含量（已知VC纯品的a=56L/g cm）,98.4%,
