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1、组织培养技术,Tissue Culture Techniques(In Vitro Culture),概述,.绪言/Introduction.细胞生长的基本需要/Basic requirement of cell growth.细胞培养的配备/Equipment.清洁、消毒与灭菌/Cleaning,Disinfection and Sterilization.无菌操作/Aseptic technique.培养细胞的形态/Morphology of culture cell,I.绪言/Introduction,1.概念/Concept2.发展史/Developing history3.应用/Ap
2、plication,1.概念,体外培养/In vitro culture将动植物活体内取出的组织、细胞或器官等，放置在类似体内生存环境中，使其维持、生长或繁殖的方法。whole culture microorganism parasite organ culture parts culture tissue culture cell culture,器官培养/Organ culture,体外器官原基或整个器官或部分器官的维持或生长，包括结构和功能上的维持和分化。（The maintenance or growth of organ primordia or the whole or parts
3、 of an organ in vitro,in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture and/or function.）,Organ culture,组织培养/Tissue culture,体外组织的维持或生长，包括结构和功能上的维持和分化。（The maintenance or growth of tissue in vitro,in a way that may allow differentiation and preservation of the architecture
4、and/or function.）组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）,细胞培养/Cell culture,是指单细胞在体外培养。（This term is used to denote the growing of cell in vitro,including the culture of single cell.）通常体外培养中的单细胞不再形成组织。细胞培养也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。,细胞培养的类型/Types of cell culture,（1）原代培养/Primary culture（2）传代培养/Subculture（ce
5、ll line）,（1）Primary culture,直接来自活体的细胞（组织或器官）的初次培养。（A culture start from cells,tissues or organs taken directly from organisms.）严格地说，是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。实际应用上，常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。,新生大鼠肺成纤维细胞（原代）培养的天数：48h 放大倍速：倒置显微镜 X40培养基种类：1640+10%小牛血清 细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长,
6、幼兔骨髓基质干细胞（原代）：细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞 培养的天数：五天后放大倍数：倒置显微镜 X40培养基种类：DMEM+20%胎牛血清细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长,传代/passage or subculture将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶的过程。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存 培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。,原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期,（2）Subculture,细胞系/Cell line原代培养成功后的细胞，传代再培
7、养，称细胞系。有限细胞系/Finited cell line无限细胞系/infinited cell line,有限细胞系/Finited cell line细胞群体在体外生长有一定限度，即体外传代（passage or subculture）到一定次数时，细胞停止繁殖、衰退、死亡。一般情况下可传代10-50次。无限细胞系/infinited cell line细胞群体能无限制生长下去，不进入衰退期。肿瘤细胞系可无限增殖；正常细胞系可发生自发转化，使细胞获得永久增殖的能力。,Infinited cell line:Hela,细胞株（cell strain）用单细胞分离培养或通过筛选的方法，从原
8、代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株,体内培养/In vivo culture是将活体的组织细胞、器官等取出，放置在其它生物体内让其生长和发育的方法。器官移植/transplantation干细胞/stem cell,2.发展史,19世纪末，20世纪初温生理盐水培养鸡胚髓板组织存活数天提出组织培养(tissue culture)概念（1885 Roux）血浆凝块试管中培养成年兔肝、肾、甲状腺、卵巢植块3天早期器官培养（1897 Loeb）应用悬滴培养法，用动物血清培养狗的肉瘤细胞，存活约72小时。（1906 Beebe等）短期存活，没有细胞的生长和增殖。,悬滴法培养蛙胚
9、神经组织存活了几个星期,且从培养的细胞中长出了轴突完善了体外培养体系，体外培养技术的开始（1907 Harrison）改良悬滴培养法培养鸡胚心肌细胞数年将无菌操作技术（aseptic technique）引入体外培养发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子（1912 Carrel）,1950s 培养技术快速发展无菌操作技术/aseptic technique 培养容器/culture flasks抗生素/antibiotics 培养基/medium培养方法/culture methodsmicrocarrier，hollow fiber culture,微栽体法Wezel在1
10、967年首创固体微珠直径约在50微米到数百微米之间将细胞悬液和微载体混合孵育,待细胞贴附于微载体上,再转移至培养液中培养借助温和搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中，细胞就能够在微载体表面迅速生长、增殖,细胞浓度可高达107个/ml。适于各种细胞的大规模培养,空心纤维法:是Richardknazek等在1972年创建的空心纤维是一种由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的可透性滤膜,外径约为1/33/4mm,表面具有海绵状多孔结构,既能使水分子、营养物质和气体透过,也能使细胞在上面贴附生长。当细胞密度达到107108个/ml时,逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。此时细胞不再增殖,但能正常生活并继续
11、分泌所需的蛋白质或其他生物制品。在生产激素和单抗时被广泛应用。,3.应用,细胞生物学/cell biology形态、发育、营养、代谢、病变等遗传学/genetics染色体分析、细胞融合、杂交、转基因等病毒学/virology病毒培养免疫学/immunology细胞因子,细胞毒试验/cytotoxic test检测有毒物质并判断其强弱（对药品、化妆品、食品添加剂、杀虫剂等进行筛选和安全评估）生物制品/biologic product(biologics)疫苗、干扰素、激素、酶、生长因子、单克隆抗体等干细胞培养/stem cell culture细胞定向诱导分化、移植肿瘤细胞培养/tumour cell culture肿瘤细胞生物学特性、肿瘤细胞发生发展、筛选抗癌药物,应用体外培养技术的优点,1.细胞种类广泛（从低等动物到高等动物，从胚胎到成体，从正常组织到肿瘤细胞）。2.能长时间直接观察活细胞的形态结构、生命活动及细胞变化，便于监控和检测，甚至定量。3.研究样本的均一性强。4.易于采用物理、化学和生物因素等进行实验研究。5.研究所需费用相对体内实验较为经济。,应用体外培养技术的不足之处,1.任何组织或细胞置于体外培养后，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变，不能将其与体内的细胞完全等同。2.在应用传代细胞时，反复长期传代可能导致染色体的改变。3.不能体现生物整体效应,
